Ingestion of nitrates in drinking water has long been thought to be a primary cause of acquired infantile methemoglobinemia, often called infantile methemoglobinemia. However, recent research and a review of historical cases offer a more complex picture of the causes of infantile methemoglobinemia. Gastrointestinal infections and other inflammatory conditions and the consequent overproduction of nitric oxide appears to be the primary cause of infantile methemoglobinemia. This revelation suggests current regulations limiting nitrates in drinking water, which are based solely on the health threat of infantile methemoglobinemia, may be unnecessarily strict. Key words: infantile methemoglobinemia, diarrhea, drinking water, gastrointestinal disturbance, methemoglobinemia, nitrates, nitric oxide.

Address correspondence to A.A. Avery, Hudson Institute, Center for Global Food Issues, PO Box 202, Churchville, VA 24401 USA. Telephone: (540) 337-6354. Fax: (540) 337-8593. E-mail: aavery@rica.net

Methemoglobin is a form of hemoglobin in which the heme iron is reduced to its ferric state and is unable to deliver oxygen. Methemoglobinemia results when amounts of methemoglobin in the blood become high enough to manifest clinical symptoms of cyanosis, usually about 15% of total circulating hemoglobin. Methemoglobinemia occurs for various reasons, including genetic deficiencies in key methemoglobin-reducing enzymes, genetic abnormalities in hemoglobin that make the protein more susceptible to oxidation, and exposure to oxidant drugs and chemicals, including nitrite. Infants under 6 months of age are particularly susceptible to methemoglobinemia because they have lower amounts of a key enzyme, NADH-cytochrome b₅ reductase (methemoglobin reductase), which converts methemoglobin back to hemoglobin. Infants begin making adult levels of this enzyme by about 6 months of age (1). Although it has often been reported that high levels of fetal hemoglobin in the blood of young infants contributes to their increased susceptibility to methemoglobinemia, it has been demonstrated that fetal hemoglobin has the same redox potential and rate of auto-oxidation as hemoglobin A and therefore does not contribute to the increased vulnerability (1).

For over 40 years, there has existed a widespread belief that nitrates in drinking water are a primary cause of infantile methemoglobinemia. Hunter Comly originally proposed this theory in 1945 in a report in the Journal of the American Medical Association after treating several infantile methemoglobinemia victims exposed to nitrate-contaminated water (2). Comly proposed that because nitrites (NO₂^-) are known to react directly with hemoglobin to form methemoglobin, nitrates (NO₃^-) from drinking water must be converted to nitrites within the gastrointestinal tract of infants. Because many infants did not appear susceptible to methemoglobinemia from nitrate-contaminated water, Comly (2) suggested that the nitrate-to-nitrite conversion might only occur in the presence of a bacterial infection of the upper gastrointestinal tract, where such reactions could occur before nitrates are absorbed. These bacterial-derived nitrites could then react with hemoglobin to form methemoglobin and, in sufficient quantities, lead to the cyanosis of methemoglobinemia.

Comly's theory (2) became widely accepted as additional infantile methemoglobinemia cases with elevated nitrates in the water were reported. Limiting infant exposure to nitrates was therefore decided to be the most prudent approach to protecting infant health, and a committee from the American Public Health Association (APHA) conducted a nationwide survey to determine a safe level of nitrates in water. Data on a total of 214 cases were compiled. The results showed methemoglobinemia incidence correlated with increasing nitrate levels (Table 1) (3). Because no infantile methemoglobinemia cases were observed with concentrations < 10 ppm nitrate-nitrogen (nitrate-N), the United States and the World Health Organization established a maximum contaminant level (MCL) of 10 ppm nitrate-N for nitrate in drinking water.

Table 1. Reported Cases of Nitrate Water-Induced Infant Methemoglobinemia Classified According to Nitrate-Nitrogen Concentration of Water Used in Feeding Formula

	Methemoglobinemia		Number of cases associated with indicated ranges of nitrate-N concentration (ppm)						Cases with available data
State	Reported cases	Reported deaths	0-10	11-20	21-30	31-50	51-100	100+	Cases with available data
California	1	0	0	0	0	0	1	0	1
Georgia	6	3	—	—	—	—	—	—	0
Illinois	75	6	0	1	2	2	12	11	28
Indiana	1	0	0	0	0	0	1	0	1
Iowa	Several	11	0	0	0	0	1	1	2
Kansas	13	3	0	0	1	1	2	8	12
Michigan	7	0	0	0	0	0	0	7	7
Minnesota	139	14	0	2	25		53	49	129
Missouri	2	0	0	0	0	0	0	2	2
Nebraska	22	1	0	1	0	4	9	8	22
New York	2	0	0	0	0	0	1	0	1
North Dakota	9	1	0	1	1	0	0	6	8
Ohio	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Oklahoma	0	0	0	0	0	0	0	0	0
South Dakota	Several	0	—	—	—	—	—	—	—
Texas	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Virginia	1	0	0	0	0	0	1	0	1
Total	278+	39	0	5	36		81	92	214
Percent of Total			0.0	2.3	16.8		37.8	43.1	100

*Based on Table 1 from Walton (3).

Over the last 20 years, however, a more complex picture of infantile methemoglobinemia causation has emerged which indicates that current limits on drinking water nitrates may be unnecessarily strict. It is now well established that diarrheal illness and some gastrointestinal disturbances, typically accompanied by diarrhea and/or vomiting, can lead to methemoglobinemia in young infants without exposure to high-nitrate drinking water or exposure to abnormal levels of nitrates through food. There are literally dozens of reported infantile methemoglobinemia cases associated with diarrhea without exposure to nitrate-contaminated water (4-10). Because diarrhea was a prominent symptom in the majority of drinking water-linked methemoglobinemia cases, the evidence suggests that diarrhea and/or gastrointestinal infection/inflammation, not ingested nitrates, are the principle causative factor in infantile methemoglobinemia; a survey in Germany found that 53% of 306 infantile methemoglobinemia cases reported diarrhea (11). (Contrary to some reports, diarrhea and vomiting are not symptoms that typically accompany cyanosis, methemoglobinemia due to oxidant drug exposure, or genetic abnormalities in hemoglobin.)

A putative mechanism whereby gastrointestinal inflammation leads to methemoglobinemia has been established. Nitric oxide (NO) is produced by several tissues in response to infection and inflammation. Increased expression of an inducible nitric oxide synthase (iNOS) mRNA has been observed in young children with inflammatory bowel disease during periods of colonic inflammation, but not, however, in the absence of colonic inflammation (12,13). A rapid up regulation of iNOS mRNA is also seen in colon epithelial cells upon infection with enteroinvasive bacteria (14). Nitrite is a product of nitric oxide metabolism, and increased expression of iNOS mRNA from colonic inflammation is accompanied by increased stool and plasma nitrate/nitrite levels (13). In young infants, overexpression of nitric oxide can lead to nitrite production sufficient to overwhelm the underdeveloped methemoglobin-reducing system, resulting in methemoglobinemia. Indeed, methemoglobinemia is a well-known side effect of nitric oxide therapy for acute respiratory distress syndrome and persistent pulmonary hypertension in newborns, and such therapy requires close monitoring of methemoglobin levels (15).

This is supported by observations that infants suffering from diarrhea and methemoglobinemia (without exposure to nitrate-contaminated water) excrete up to 10 times more nitrate daily than they ingest through food or water (16). As nitrites are metabolized to nitrates before excretion, excess nitrate excretion is an indicator of endogenous nitrite production. Infants with methemoglobinemia associated with gastroenteritis and/or dehydration also have significantly longer average hospital stays than infants with methemoglobinemia secondary to oxidant drug exposure, indicating chronic, endogenous oxidant stress--presumably endogenous nitrite production from nitric oxide (17). Despite similar initial methemoglobin levels in the endogenous (mean, 29%) and exogenous (mean, 28%) groups, children in the endogenous group stayed an average of 19 days in the hospital, whereas in the exogenous group, methemoglobinemia resolved within 1 day. As Avner et al. (17) stated,

The shorter, more benign course of illness [of children with methemoglobinemia due to acute poisoning] may reflect a relatively brief exposure to the oxidant stress ... compared with ongoing exposure over a prolonged period in children with methemoglobinemia associated with gastroenteritis and dehydration.

Protein intolerance accompanied by diarrhea and/or vomiting has also been proven to cause methemoglobinemia in infants less than 6 months of age without excessive intake of nitrates through food and water (18,19). Methemoglobin levels over 35% have been recorded in protein-intolerant infants following brief exposure to the offending protein (18). Moreover, although over 90% of exogenous nitrate exposure comes from food, the only methemoglobinemia cases linked to food have involved high levels of nitrite contamination. For example, a typical case involved carrot juice containing 775 ppm nitrite-N, which is over 700 times the MCL for nitrites (20). All of these observations strengthen the view that endogenous nitrite production, not exogenous nitrate contamination of drinking water, is the primary cause of methemoglobinemia.

Figure 1. The seasonal variation in the incidence of methemoglobinemia in a region of Israel during a 12-year period (1980-1992). Data from Hanukoglu and Danon (19).

Epidemiological evidence suggests that many infantile methemoglobinemia cases may also have an infectious etiology. A 54-year-old woman who suffered chronic methemoglobinemia for 15 years saw a disappearance of the condition after a 10-day course of neomycin (21). Infantile methemoglobinemia resulting from urinary tract infection has been reported in over a dozen instances (22,23). Infectious bacterial and viral gastroenteritis may underlie many infantile methemoglobinemia cases. Several methemoglobinemia cases have been reported as resulting specifically from bacterial enteritis or suspected bacterial sepsis without exposure to high nitrate water (24-26). Further, an Israeli study of 45 infant methemoglobinemia cases over a 12-year period (all from urban areas with normal concentrations of nitrate in the drinking water) revealed a seasonal variation in methemoglobinemia incidence (19). The incidence of methemoglobinemia showed two peaks, in January (n = 7, 16%) and in the summer months (n = 23, 51%; Figure 1). As Hanukoglu and Danon (19) noted,

these [incidence] peaks correspond to times when infectious gastroenteritis is common (viral agents, especially rotavirus, in winter and bacterial agents in summer).

Hanukoglu and Danon (19) further noted that the declining incidence of methemoglobinemia observed over a decade also supported an infectious etiology (Figure 2).

The incidence of methemoglobinemia was highest before 1980 and decreased significantly to a minimum during the last 6 years of our survey. This was paralleled by a significant decrease in infant morbidity and hospitalization rates of patients with infantile diarrhea due to bacterial pathogens in our hospital during the same period, despite the increase in the pediatric population in the area served by our hospital. Presumably the morbidity of non-bacterial gastroenteritis is also decreasing. A similar trend was also observed over the whole country.

Figure 2. The number of patients hospitalized for methemoglobinemia in a region of Israel from 1980 to 1992. Data from Hanukoglu and Danon (19).

A similar drop in methemoglobinemia incidence appears to have occurred in the United States during the 1950s and 1960s.

Implications for Regulation

There are a number of considerations to examine regarding a regulatory drinking water nitrate limit. We know that exposure to even high levels of exogenous nitrates in drinking water is insufficient by itself to cause methemoglobinemia, even among young infants. This was demonstrated conclusively by experiments conducted with human infants in the 1940s. Four healthy infants ranging from 2 days to 6 months of age were fed formula prepared with water containing ~100 ppm nitrate-N. Despite ingesting such highly contaminated formula for more than a week, the highest methemoglobin level observed was 7.5% with no cyanosis evident in any of the patients. Even when fed to several infants hospitalized for methemoglobinemia ostensibly linked to nitrate contaminated water, the highest methemoglobin level recorded was 11 percent (27). As the researchers noted, “it appeared that there were other factors in addition to the quantity of nitrate ion ingested that determined whether or not an infant became cyanotic.” All available evidence points to diarrhea, gastrointestinal inflammation (i.e. from protein intolerance), or infection as the critical factors.

If nitrates do not cause methemoglobinemia, how much do exogenous nitrates exacerbate methemoglobinemia caused by other factors? This is the critical question for establishing a sound regulatory health standard for nitrate in drinking water.

The U.S. drinking water standard of 10 ppm nitrate-N was established following review of data from just 214 cases. As reported by Walton in 1951 (3), “Special emphasis was placed on restricting the data to those cases definitely associated with nitrate-contaminated water.” This created an inherent bias in both the APHA survey and in the medical community, where it was assumed that nitrates caused any infantile methemoglobinemia case with above normal nitrates in the water. By excluding low-nitrate infantile methemoglobinemia cases, the APHA survey was virtually guaranteed to find that any nitrate concentration above background was unsafe. If all infantile methemoglobinemia cases had been included in the APHA survey, not just those with above normal nitrate levels, it would have been discovered much sooner that severe infantile methemoglobinemia can occur at all levels of nitrate exposure—from zero ppm nitrate-nitrogen upward—and that diarrhea and gastrointestinal problems are the real cause. The medical literature includes reports of cyanosis associated with diarrhea as far back as 1904.

The current 10 ppm standard is also based on very limited and poor quality case information. The APHA survey did not report the presence of nitrite, bacteriologic contamination, gastrointestinal disease, diarrhea, or methemoglobin concentration. Walton wrote, “It should be noted, that in many of these cases clinical data were insufficient for definite diagnosis, and samples of water for the analysis were sometimes collected several months following the occurrence of the case.” (3) This is hardly a sound scientific basis for any regulation, let alone one with as much cost to society as the nitrate standard.

Some groups, especially environmental groups, have used the existence of methemoglobinemia cases at drinking water nitrate concentrations below 10 ppm nitrate-N to argue that the current federal standard should be reduced to 5 ppm. At what point does one stop with this logic? Does the existence of methemoglobinemia cases at water concentrations of 1 ppm nitrate-N require a standard below this level?

Conclusion

There is little question that high levels of nitrates in drinking water can contribute to the severity of methemoglobinemia caused by other factors. What constitutes “high nitrate levels” is open to debate however, and this is an area where the unquestioning attitude of the public health community has stifled research that would have yielded valuable case information and epidemiological data.

I have argued, based on extensive review of infantile methemoglobinemia research and a century’s worth of case reports, that the drinking water nitrate standard could be raised to 15 or 20 ppm without increasing the risks to infants. This is based primarily on the bias and poor quality data in the single study on which the current regulatory standard is based, as discussed above. A more complete data set would likely indicate that methemoglobinemia cases occurring with water at 15-20 ppm nitrate nitrogen were primarily the result of bacterial contamination or other severe gastrointestinal causes, and endogenous oxidative stress, not the relatively low nitrate contribution from water used to prepare or dilute the infant formula. The vast majority of case reports are with nitrate levels above 30-40 ppm nitrate nitrogen. However, the problem with any proposed standard is the fact that infantile methemoglobinemia can occur with zero nitrate exposure, which creates a conundrum: how does one measure the contribution of relatively low levels of nitrates to the severity of a infantile methemoglobinemia case in order to establish a scientifically-sound nitrate standard? Such a standard is predicated on the false notion that nitrates are the primary cause of infantile methemoglobinemia.

Much more research on infantile methemoglobinemia is needed before these questions could be answered with enough clarity to properly advise public health policy. The answer may also be that no definite conclusions can ever be drawn and zero exogenous nitrate exposure is the only absolutely safe exposure for young infants. If that were the case, feeding infants reconstituted or diluted concentrated formula would be prohibited.

It is clear, however, that limiting nitrates in drinking water is not effective at preventing infantile methemoglobinemia. The case literature now abounds with cases in which there are no nitrates in the water. While nitrates may contribute to the severity of infantile methemoglobinemia, especially at high levels above 40 ppm nitrate nitrogen, the evidence indicates they do not cause it. If the goal is protecting infant health, then the best approach would be to prevent and treat the conditions that actually cause infantile methemoglobinemia, such as bacterial and viral gastroenteritis.

Instead of focusing on nitrate levels in drinking water, which has distracted doctors and public health officials from the real problems, we should educate everyone that any infant less than six months of age with diarrhea or other gastrointestinal illness—especially low birth weight and premature babies—is at risk of infantile methemoglobinemia. The nitrate scare has fooled us for too long.

References and Notes

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La toxicologie est une discipline qui observe les effets pour l’homme des produits chimiques, simples ou composés, naturels ou résultant de l’activité humaine. Elle suppose des connaissances médicales et des connaissances chimiques.

Les intoxications aiguës sont parfaitement connues depuis plus d’un siècle et la description des effets nocifs survenant en quelques jours ou quelques semaines s’accumulent dans tous les livres de toxicologie.

Pour les affections d’apparition lente, lors de l’utilisation d’eaux chargées en minéraux comme les fluorures ou certains dérivés de l’arsenic, les intoxications chroniques (fluoroses, arsenicismes) sont bien connues.

Depuis des décennies, une réglementation mondiale définit ce que la collectivité scientifique appelle l’eau potable. Les ions nitrates y figurent au taux maximum de 50 mg/l. Il ne s’agit pas de concentrations dangereuses ou nuisibles à la santé d’une collectivité, mais d’un taux dit de précaution.

Est-il utile de réclamer une eau potable contenant moins de minéraux dissous ? La réponse médicale est évidemment non.

L’augmentation du facteur de sécurité peut être une satisfaction intellectuelle ou idéologique, mais aucun toxicologue ne s’attache à la surabondance des précautions inutiles.

Le cas des nitrates est exemplaire, parce que le taux nocif dans l’eau de boisson n’est pas réellement « connaissable » puisque ces ions sont présents dans les aliments végétaux et que l’analyste ne peut différencier dans un estomac humain la part revenant à l’eau et celle revenant aux aliments : donc la question n’a aucun sens.

En résumé, première notion toxicologique fondamentale : tout ion nitrate absorbé qu’il provienne de l’eau, des aliments (ou de l’air respiré) est identique à son voisin. C’est une loi de chimie des molécules, connue depuis plus de deux siècles.

Rappel de toxicologie « quasi-expérimentale » aiguë des nitrates .

Depuis des siècles, les nitrates sous forme de sel de potassium (sel de terre, salpêtre) ont été prescrits à la dose de plusieurs grammes par des médecins. Ils étaient considérés essentiellement comme diurétiques en cas d’œdèmes cardiaques, diurèse vraisemblablement obtenue par la concentration osmotique de l’urine riche en nitrate ; c’est encore le composant essentiel de nombreuses tisanes.

Les nitrates ne sont pas irritants, allergisants, mutagènes, ou tératogènes aux doses absorbées par la population. Donc pas de menace de maladies tardives, pas de crainte pour la Santé Individuelle.

Les seules anomalies authentiquement écrites par les médecins pédiatres et les toxicologues (humains et vétérinaires) sont des cas de cyanose avec méthémoglobinémie rares, observés chez les nourrissons absorbant des biberons trop riches en nitrites.

Deuxième constat évident, mais essentiel

Les nitrates ajoutés à l’hémoglobine ne forment pas de méthémoglobine.

Or, une règle de la toxicologie impose pour toute intoxication une explication chimique, un mécanisme comprenant une formule de réaction, un équilibre par loi d’action de masse, des inhibiteurs et des catalyseurs. Les nitrites se présentent comme de bons candidats à l’intoxication. Ils sont rapidement absorbés, forment des dérivés nitrosés biologiques. De vieilles pratiques de charcuterie utilisent des nitrites pour donner aux viandes conservées une belle couleur rouge de nitroso-myoglobine. A dose suffisante, les ions nitrite débordent l’action d’une méthémoglobine réductase physiologique présente dans l’hématie.

Le toxicologue qui n’observe pas de cyanose tant avec les nitrates qu’avec une petite quantité de nitrites dira au minimum et très naturellement toxicité des nitrates = Impossible.

Confronté aux observations des pédiatres, très peu nombreuses mais indiscutables, il s’interroge et cherche un mécanisme réducteur puissant, éventuellement une disposition génétique, congénitale ou pathologique expliquant la sensibilité du nourrisson.

Les théories explicatives modernes de la nocivité des produits nitratés chez le nourrisson passent en effet par une étape réductrice bactérienne avec formation de nitrites, directement méthémoglobinisants chez certains nourrissons dont la fonction méthomoglobine-réductase physiologique est peu active. La formation de nitrites serait la conséquence des pullulations de bactéries réductrices existant soit dans le biberon, soit dans le colon de l’enfant, important réservoir bactérien (normal ou pathologique – les diarrhées sont fréquentes).

L’hypothèse biberon est de loin la plus solide car son contenu est un milieu de cultures idéal.

Interdire de donner aux nourrissons une eau contenant plus de 50 mg/l de nitrates n’est qu’une précaution accessoire. L’important étant que l’eau ne contienne pas de germes pathogènes, banal problème d’hygiène…

Le taux en nitrates étant nettement plus élevé dans la plupart des bouillons de légumes, soupes et purées végétales, leur conservation doit aussi être surveillée et les mères instruites du danger potentiel. Depuis les découvertes Pastoriennes, l’hygiène de l’eau passe par sa non contamination par des déchets et des rejets organiques en raison de la transmission toujours possible de germes du genre Colibacilles, Salmonelles et autres facteurs de diarrhées, infections et toxi-infections graves.

La présence de nitrates dans les végétaux comestibles étant constante, le toxicologue clinicien qui ne constate aucune perturbation de la santé des végétariens et des végétaliens est parfaitement tranquille, aussi bien pour l’individu que pour les générations successives, dès lors que les carences sont évitées.

Une troisième loi de la toxicologie moderne rappelle que les nuisances ne sont pas synonymes d’intoxications immédiates ou tardives. La première nuisance chimique est l’odeur.

Des liquides biologiques aussi abondants que la salive contiennent des nitrites physiologiques.

Le suc et contenu gastrique au contraire n’en contiennent pratiquement pas malgré l’absorption de salive, ce qui suppose un passage extrêmement rapide des nitrites vers le sang, puis une destruction rapide dans l’estomac.

C’est un point essentiel de toute discussion toxicologique. Les produits « anthropiques », synthétisés par l’homme aux concentrations physiologiques, sont difficilement retenus comme cause normale de cancers, de maladies dégénératives, d’apoptoses et de vieillissement prématurés.

Quid des nitrosamines ?

Expérimentalement l’ingestion prolongée à doses élevées, prolongées et compatibles avec la survie, d’un mélange de nitrite de sodium et de certaines amines provoque indiscutablement des cancers gastriques chez le rat, mais l’estomac de l’homme normal ne contient pratiquement pas de nitrites.

Les nitrosamines (alimentaires ?) devraient avoir une action limitée à la cavité buccale. Encore faudrait-il les trouver là. A ce niveau, on parle plutôt de l’effet du tabagisme et de l’alcool.

Sauf à parler de cancérogenèse endogène, il est difficile de faire jouer un rôle mutagène et/ou cancérogène à une série radicalaire fabriquée dans l’organisme humain (anthropique) et qui conduit aux nitrites et nitrates.

Vient la très importante découverte des oxydes d’azote biomédiateurs vasculaires et produit de défense cellulaire, nouveauté d’importance considérable, NO et NO2 étant effectivement synthétisés dans l’organisme humain à partir d’aminoacides proches du cycle de l’urée.

Le cycle des oxydes d’azote va répondre très simplement aux observations d’allure paradoxale comme la synthèse « in situ » de NO, puis de nitrites, comme l’effet thérapeutique d’esters nitrés organiques comme le trinitrate de glycérol, trinitrine ou nitroglycérine.

NO a été reconnu comme un régulateur physiologique de la circulation sanguine (ce qui n’est pas indiqué dans la plupart des rapports officiels, alors que le phénomène était connu de tout biologiste).

Le radical NO est normalement formé dans l’organisme par un groupe d’enzymes : les Monoxydes d’azote-Synthases, enzymes oxydants puissants puisqu’ils réalisent précisément la formation de NO à partir d’aminoacides.

En conclusion, le thème nitrates est paradoxalement utilisé comme symbole de toxicité, alors qu’il s’agit de produits dont la toxicité humaine pratique (risk) aiguë, subaiguë et chronique est strictement nulle. Loin de s’indigner de tels contresens, le toxicologue constate simplement les énormes dérives de l’information de vulgarisation par rapport aux connaissances scientifiques les plus simples.

La question de savoir si l’exposition au nitrate peut constituer un facteur de risque de cancer pour l’homme est loin d'être résolue. La réduction du nitrate par une large variété de microorganismes peut produire des agents nitrosants susceptibles de générer des composés N-nitrosés (CNO) cancérogènes in vitro et in vivo.

Environ 90 % des 300 CNO étudiés induisent des tumeurs dans une grande variété d’organes chez 41 espèces animales incluant des primates et n'épargnent probablement pas l'homme. Les CNO figurent parmi les plus puissants cancérogènes connus et de faibles doses, parfois une seule, de ces CNO suffisent à induire des tumeurs chez l’animal. Les CNO exercent leurs effets cancérogènes après leur conversion métabolique (nitrosamines) ou non enzymatique (nitrosamides) en dérivés instables et réactifs qui constitutent les cancérogènes ultimes. Les espèces actives alcoylantes formées sont de puissants électrophiles qui peuvent réagir avec les sites nucléophiles des macromolécules cellulaires telles que ADN, ARN et protéines. L’ADN constitue la cible cellulaire critique car certaines lésions non réparées avant la réplication peuvent conduire à des mutations. Celles-ci peuvent initier une transformation néoplastique. Les voies métaboliques des CNO, la formation d’adduits et les mécanismes de réparation de l’ADN ainsi que les symptômes de toxicité aiguë apparaissent similaires chez l’animal et chez l’homme. Le cancer humain (leucémie aiguë non lymphocytaire) a été induit par des médicaments cytostatiques de la famille des nitrosourées utilisés en chimiothérapie. L’utilisation de tabac à chiquer serait responsable de l’accroissement de l’incidence du cancer de la cavité buccale avec une haute probabilité.

La réduction du nitrate en nitrite ou NO produit des agents nitrosants pouvant conduire aux CNO cancérogènes suite à leur réaction avec des substrats azotés. Ces agents (NO⁺, N₂O₃, N₂O₄, NOX) peuvent réaliser la nitrosation dans des conditions et milieux variés. Certaines bactéries, notamment présentes dans le suc gastrique humain, agissent comme catalyseurs efficaces de la réaction de N-nitrosation, et générent des CNO. Certains anions catalysent la formation des CNO, alors que d’autres composés, tels que les vitamines C et E, des composés phénoliques et mélanges naturels les contenant peuvent l’inhiber. En particulier, légumes et fruits sont très riches en composés inhibiteurs de la N-nitrosation. Alors que les nitrosamines volatiles et les nitrosaminoacides ont été beaucoup étudiés, la nature des CNO formés in vivo ou préformés dans l'environnement reste encore largement mal connue.

La réduction du nitrate est réalisée par une large variété de microorganismes. Certaines circonstances, par exemple de mauvaises conditions de stockage, accroissent la vitesse de transformation bactérienne du nitrate. Ainsi des produits naturellement riches en nitrate accumulent du nitrite, la formation de CNO pouvant survenir subséquemment. L’étude de l’absorption et du métabolisme du nitrate montre qu’il peut être une source de nitrite dans différents compartiments in vivo. Le nitrate ingéré est absorbé au niveau du tractus gastrointestinal dans la circulation sanguine. Il se trouve ensuite transporté pour environ 25 % jusqu’aux glandes salivaires. La réduction bactérienne dans la cavité buccale est affectée par le pH salivaire et la composition de la microflore, elle-même dépendante de la nutrition et de l’état de santé des personnes. Dans l’estomac, l’achlorhydrie permettant une colonisation bactérienne peut entraîner la présence de teneurs élevées de nitrite. Le nitrate peut aussi subir une réduction dans l’intestin grêle et la vessie. La biosynthèse endogène de NO et donc de nitrate est réalisée à partir de l’arginine par certaines cellules en réponse à une stimulation immunologique lors d'états inflammatoires ou infectieux. La synthèse endogène de CNO chez l’animal et chez l’homme a été largement démontrée, en particulier, grâce à la mesure de nitrosoproline et autres nitrosaminoacides dans l’urine. Des études ont permis de démontrer que : a) l’exposition au nitrate peut être corrélée à la capacité de nitrosation endogène ; b) la nitrosation endogène est modulée par des composés inhibiteurs tels que les vitamines C, E, les composés phénoliques et des mélanges naturels complexes ; c) la capacité de nitrosation endogène est corrélée à un taux élevé de cancers (estomac, oesophage) dans certaines populations ; d) La nitrosation endogène est plus élevée dans des états pathologiques associés à un risque accru de certains cancers.

Un gand nombre d’études épidémiologiques visant à mettre en évidence une corrélation entre le taux de mortalité ou l’incidence de certains cancers (estomac, oesophage) et l’exposition au nitrate ont été réalisées dans de nombreux pays. Des résultats contradictoires ont été obtenus. Ces divergences peuvent être expliquées par des difficultés liées à la mesure de l’exposition au nitrate, telles que : a) la diversité des indicateurs et des méthodologies utilisés ; b) certaines habitudes alimentaires ; c) l’apport conjoint nitrate/vitamines, produits phénoliques et autres composés inhibiteurs de la nitrosation et modulateurs de la cancérogenèse ; d) les pollutions accompagnant celle du nitrate (pesticides, arsenic) ; e) la période de latence entre l’exposition au nitrate et la maladie ; f) les mouvements des populations. De plus, la nature de la source d’exposition au nitrate pourrait être d’importance capitale. En effet, alors que les légumes apportent conjointement au nitrate des éléments protecteurs, inhibiteurs de la nitrosation (e.g. vitamine C, polyphénols) l’eau, source possible de nitrate, est dépourvue de tels éléments. La corrélation entre l’exposition au nitrate et le risque de cancer de l’estomac peut varier en fonction du type de légumes, sources de nitrate (e.g. légumes verts par rapport aux céréales).

Le nitrate apparaît comme un élément parmi les multiples facteurs impliqués dans la formation endogène de CNO, en particulier : a) La capacité de réduction du nitrate en nitrite in vivo et l'étendue de la nitrosation bactérienne, dépendantes de l'existence, de la nature et de l'activité des bactéries dans la cavité buccale, dans un environnement gastrique achlorhydrique ou dans d'autres sites infectés comme la vessie; b) le flux salivaire ; c) la nature et la concentration des substrats nitrosables ; d) la présence de catalyseurs ou d’inhibiteurs de la nitrosation ; e) le pH du compartiment corporel concerné.

Les données actuelles des études épidémiologiques ne permettent pas de tirer une conclusion définitive quant au risque cancérogène dû à l’exposition à de fortes concentrations de nitrate. Des études du risque individuel de cancer en fonction de l’exposition individuelle au nitrate plutôt que des comparaisons globales seraient probablement plus informatives. L'exposition au nitrate pourrait constituer un élément nécessaire mais insuffisant du risque cancérogène qui dépendrait largement de facteurs individuels. Face à la complexité de la situation, aux informations disponibles largement incomplètes, à l'existence de certains groupes de population pouvant présenter une sensibilité particulière (achlorhydrie gastrique, infections microbiennes), ainsi qu'à la présence ubiquitaire de bactéries dans notre environnement, le risque ne peut pas être écarté. Il semble justifié de rechercher des moyens de prévention pour éviter l’exposition de l’homme au CNO notamment en limitant les concentrations de leurs précurseurs dans l’environnement et en particulier celles de nitrate. Il serait souhaitable d'éviter de trop fortes teneurs en nitrate dans les légumes pour conserver leurs effets bénéfiques en évitant un risque à long terme pour la santé humaine. Quant aux normes actuelles admissibles de nitrate dans l'eau, la prudence recommande leur maintien.

Docteur Jean-Louis L'HIRONDEL

CHRU CAEN

Dualité des nitrates

Nitrates et méthémoglobinémie : essai de clarification sur la santé

NITRATES ET METHEMOGLOBINEMIE DU NOURRISSON

ESSAI DE CLARIFICATION

Comme le précise en 1995 le Comité Scientifique de l’alimentation humaine de la Commission Européenne, l’ensemble des travaux épidémiologiques entrepris au cours des dernières décennies ont échoué dans leur tentative de démontrer une quelconque carcinogénicité des nitrates (EU, 1995). La réglementation des taux de nitrates dans l’eau de boisson n’a ainsi actuellement d’autre intention que de chercher à prévenir la méthémoglobinémie du nourrisson (WHO, 1993).

De ce fait, le thème nitrates-méthémoglobinémie du nourrisson est crucial ; il mérite d’être examiné de près.

Tentant d’apporter des éléments de clarification à un débat qui dure depuis plus de cinquante ans, l’auteur met l’accent sur quatre idées ou notions qui, quoique erronées, continuent à avoir cours.

Ces quatre idées erronées sont celles qui consistent à considérer :

- que les nitrates de l’alimentation peuvent être transformés en nitrites in vivo dans le tube digestif du nourrisson,

- que, dans un biberon contenant des nitrates, les nitrites commencent à apparaître dès le début de la prolifération bactérienne,

- que les données épidémiologiques relatives à l’eau de puits et au risque méthémoglobinémique qu’elle fait courir sont transposables à l’eau du robinet,

- enfin que les normes établies pour les taux de nitrates dans l’eau potable, donc entre autres dans l’eau du robinet, ont jadis été fondées sur des bases scientifiques solides.

Au contraire, comme le montrent les faits et données scientifiques rapportés par l’auteur,

- quand elle se produit et est à l’origine d’une méthémoglobinémie du nourrisson, ce qui est devenu de nos jours tout à fait exceptionnel, du moins aux Etats-Unis et en Europe Occidentale, la transformation nitrates-nitrites se fait dans le biberon, à l’occasion d’une faute d'hygiène caractérisée ;

- la transformation nitrates-nitrites dans le biberon ne commence à apparaître que lorsque la prolifération bactérienne est déjà très avancée ; le seuil de prolifération bactérienne au delà duquel la transformation nitrates-nitrites commence à apparaître se situe autour de
10⁷ germes ml^-1 ;

- quels qu’aient pu être par ailleurs ses concentrations en nitrates (en Europe, elles dépassent encore souvent la norme de 50 mg NO₃^- l^-1), jamais l’eau du robinet, bactériologiquement saine et contrôlée, n’a été à l’origine du moindre cas, certain et vérifié, de méthémoglobinémie du nourrisson,

- enfin, la réglementation actuelle des taux de nitrates dans l’eau du robinet est consécutive à une interprétation défectueuse de l’enquête menée en 1949-1950 par l’American Public Health Association (1949-1950) ; le raisonnement qui la sous-tend est fondé sur un biais méthodologique.

Ainsi, quels que soient ses taux de nitrates, l’eau du robinet, qui est bactériologiquement saine avec moins de 10² germes ml^-1, ou à l’extrême rigueur moins de 10³ germes ml^-1, ne fait courir aucun risque méthémoglobinémique au nourrisson. Par ailleurs, qu’ils viennent des légumes ou de l’eau de boisson, les nitrates alimentaires ne se montrent nullement cancérigènes. Actuellement l’accent est mis au contraire sur leurs effets bénéfiques. Les nitrates alimentaires exercent un important rôle protecteur à l’égard des infections digestives ; il est également possible qu’ils exercent un rôle protecteur à l’égard des maladies cardiovasculaires.

Les nitrates alimentaires ne sont pas nocifs. Ils sont au contraire bénéfiques. Lorsqu’elles en prendront conscience, les autorités sanitaires inverseront leur position en recommandant les alimentations et régimes richement nitratés.

Nitrate and infant Methaemoglobinaemia

- attempting to clarify the debate -

Jean Louis L'Hirondel

As the World Health Organisation states (WHO, 1993), “the Guideline value for nitrate in drinking-water is established solely to prevent methaemoglobinaemia”.

The topic on nitrate and infant methaemoglobinaemia is of importance. The author attempts to clarify the issue in a debate that has lasted for fifty years; he lays stress on four statements that, though erroneous, are still currently expressed.

These four erroneous statements are as follows:

- Dietary nitrate can be reduced into nitrite in vivo in the infant digestive tract.

- In a feeding bottle containing nitrate, reduction to nitrite starts and occurs as soon as the bacterial proliferation begins.

- Epidemiological data on well water and risk of methaemoglobinaemia can be applied to tap water.

- Regulations for nitrate content in drinking water, especially in tap water, have been grounded formerly on solid bases.

On the contrary, as shown in this paper,

- The reduction of nitrate to nitrite that causes infant methaemoglobinaemia takes place in the feeding bottle as a result of a clearly unhygienic condition.

- For reduction nitrate-nitrite to start and occur in a feeding bottle, it is necessary for the bacteria to proliferate up to a threshold: 10⁷ germs ml^-1.

- Whatever its nitrate concentrations, tap water, that is bacteriologically controlled, has never been responsible for a real and unquestionable case of infant methaemoglobinaemia.

- Finally, the official limits for nitrate content in tap water are based on the results of an American Survey (APHA, 1949-1950), that were subsequently misinterpreted; a methodological bias escaped then the attention of analysts.

Professeur Nigel BENJAMIN

Head of Department – Clinical Pharmacology

St Bartholomew's and the Royal London School of Medecine

LONDON

Nouveaux effets bénéfiques des nitrates

La synthèse de l’oxyde nitrique consécutive à l’oxydation de l’arginine est maintenant bien connue. Nous avons recherché la possibilité que l’oxyde nitrique puisse être obtenu par des enchaînements de réduction, à partir de nitrate minéral, chez l’homme bien portant.

Les nitrates ingérés chez l’homme, proviennent principalement des légumes verts et de l’eau de boisson. A la suite de leur absorption dans l’estomac et la partie supérieure de l’intestin grêle, ceux-ci sont concentrés dans la salive, environ dix fois. Les nitrates salivaires sont rapidement réduits en nitrites, en présence de bactéries qui siègent à la surface de la partie inférieure de la langue. Ces bactéries sont anaérobies facultatives, et utilisent le nitrate comme accepteur d’électron en l’absence d’oxygène. Ceci entraîne des concentrations en nitrite élevées dans la salive, qui, après déglutition, est acidifié dans l’estomac. L’acidification des nitrites donne de l’acide nitreux qui se décompose spontanément pour former de très hautes concentrations d’oxyde nitrique. Nous avons nommé ce mécanisme « circulation entéro-salivaire des nitrates » (enterosalivary circulation of nitrate).

Suite à l’ingestion de 2mMoles de nitrate (dose contenue dans 50g de laitue), la concentration d’oxyde nitrique s’élève d’une valeur de base de 15 ppm à un pic de l’ordre de 100 ppm. Si ces nitrates sont donnés de même que de la laitue, l’augmentation d’oxyde nitrique beaucoup plus forte dans les gaz stomacaux, et peut atteindre plus de 400ppm chez certains sujets. Ces concentrations d’oxyde nitrique sont toxiques pour un grand nombre de microorganismes.

Nous disposons de preuves que l’objet de cette synthèse d’oxyde nitrique intragastrique porte sur la protection contre les agents pathogènes ingérés, mais également, pourrait jouer un rôle en maintenant un flux de sang dans la muqueuse gastrique. Un grand nombre d’agents pathogènes intestinaux, tels que Escherichia Coli et Salmonella sont éliminés par l’oxyde nitrique obtenu à partir des nitrites et de l’acide. Des premiers résultats chez des sujets exposés à des environnements contaminés semblent indiquer qu’une haute dose de nitrate ingérée peut protéger contre des infections dues à des aliments ou de l’eau souillés.

Nous avons également montré que la production d’acide nitrique sur la peau, était consécutive à la réduction des nitrates et nitrites, plutôt qu’à l’oxydation de l’arginine ; ceci peut, à nouveau, s’avérer fondamental dans la protection contre les infections. Nous avons montré que les nitrites de la salive, après application sur la peau, provoquent la production de grandes quantités d’oxyde nitrique, et nous en avons déduit l’hypothèse que l’oxyde nitrique produit pendant le léchage des plaies pouvait avoir un effet antimicrobien, grâce à ce mécanisme.

Plus récemment, nous avons étudié l’effet de l’application d’acides organiques et de nitrites sur des peaux humaines malades et nous avons mis en évidence que cette association était efficace pour soigner diverses maladies infectieuses de la peau.

De ces travaux, nous avons obtenu de nouvelles perspectives au sujet du nitrite minéral et de la santé humaine. Plutôt que d’être un « polluant », ou une substance toxique, il semble maintenant que les nitrates du régime constituent un composant essentiel d’un régime sain qui nous protège contre un grand nombre de maladies infectieuses. Des travaux récents ont confirmé que des individus qui consomment plus de nitrates sont également moins sujet à développer des cancers. Le danger pour les jeunes enfants de concentrations élevées de nitrates dans l’eau ont probablement été surestimés.

En conclusion, les réglementations qui limitent l’apport de nitrate des aliments et de l’eau de boisson doivent être réexaminées, en prenant en compte les effets bénéfiques potentiels d’un haut niveau d’ingestion de nitrate.

Nitric oxide synthesis resulting from arginine oxidation has been well characterised. We have been examining the possibility that nitric oxide can be generated by sequential reduction of inorganic nitrate in healthy humans.

Dietary nitrate in humans comes mainly from green vegetables and drinking water. Following absorbtion from the stomach and upper small intestine it is concentrated in saliva approximately 10 fold. Salivary nitrate is rapidly reduced to nitrite following contact with bacteria which inhabit the dorsal surface of the tongue. These bacteria are facultative anaerobes which use nitrate as a terminal electron acceptor instead of oxygen. This results in high concentrations of nitrite in saliva which, when swallowed, is acidified in the stomach. Acidification of nitrite results in the production of nitrous acid which spontaneously decomposes to form very high concentrations of nitric oxide. We have termed this mechanism "enterosalivary circulation of nitrate"

Following ingestion of 2mMoles of nitrate (the amount in 50g of lettuce), nitric oxide concentrations rise from a baseline of 15ppm to a peak of approximately 100ppm. If the nitate is given as lettuce, the rise in nitric oxide concentration is in the stomach headspace gas is much higher, with value up to 400ppm in some subjects. This concentration of nitric oxide is toxic to a large number of microorganisms.

We have evidence that the purpose of intragastric nitric oxide synthesis is to protect against swallowed gut pathogens, but also may have a role in maintaining gastric mucosal blood flow. A large number of human gut pathogens, including E. Coli and Salmonella are killed by nitric oxide generated from nitrite and acid. Preliminary results in humans exposed to contaminated environments suggest that a high nitrate intake may protect against infection from infected food and water.

We have also shown that nitric oxide production from the skin is due to nitrate and nitrite reduction, rather than from arginine oxidation, again this may be important in protection from infection. We have shown that nitrite from saliva, when applied to the skin causes the generation of large amounts of nitric oxide and we postulate that nitric oxide produced during licking of wounds may have an antimicrobial effect through this mechanism

More recently we have studied the effect of organic acids and nitrite application to diseased human skin and found this combination to be effective in curing a variety of infectious skin diseases.

From these studies we have gained a new perspective on inorganic nitrite and human health. Rather than being a "pollutant" or toxic substance, it now seems likely that dietary nitrate is an essential component of a healthy diet which will protect us against a variety of infectious diseases. Recent studies have confirmed that individuals who consume more nitrate are also less likely to develop cancer. The danger to young infants of high nitrate concentrations in water have probably been overestimated.

In conclusion, the regulations which limit the amounts of nitrate in food and drinking water need to be reassessed, taking into account the potential benefits of a high nitrate intake.

Plan de l'exposé

1. Les accidents de méthémoglobinémie liés au nitrate rencontrés chez lesanimaux domestiques

2. Quels effets à long terme_?

2.1 Observations sur le terrain (bibliographiques et personnelles)

2.2 Etudes expérimentales

2.2.1 Données bibliographiques

- sur les rongeurs de laboratoire

- sur les animaux domestiques

2.2.2 Essais réalisés à l'ENVN sur le lapin

3. Une évaluation particulièrement difficile

Conclusion

La toxicité aiguë de l'ion nitrate est bien connue des vétérinaires, mais elle s'exerce dans des conditions bien différentes de ce qui est observé dans l'espèce humaine. En effet, la méthémoglobinémie est observée essentiellement chez les ruminants adultes, principalement les bovins, lorsqu'ils consomment, non pas de l'eau mais des fourrages très riches en nitrate (au moins 5000 ppm/MS). La physiologie digestive très particulière des ruminants permet une réduction massive de l'ion nitrate en nitrite grâce aux microorganismes du rumen, et donc un effet méthémoglobinisant rapide qui est souvent fatal. Mais les très jeunes ruminants, contrairement aux enfants en bas âge, ne constituent pas une population particulièrement vulnérable et peuvent être nourris par du lait reconstitué préparé avec de l'eau riche en nitrate sans effets défavorables. Cette bonne tolérance est vraisemblablement à mettre en relation avec l'efficacité des enzymes permettant la réduction de la méthémoglobine dans les globules rouges du veau. Chez les autres espèces, la question du risque pour les nouveau-nés ne se pose pas, car ils sont nourris par le lait maternel très pauvre en nitrate.

Les risques à moyen ou long terme d'une teneur en nitrate excessive dans l'alimentation et surtout l'eau d'abreuvement, sont en revanche encore mal précisés. Sur le terrain, un certain nombre d'observations chez des animaux de rente consommant de l'eau renfermant quelques centaines de mg/L de nitrate évoquent un effet défavorable sur la croissance, la fertilité ou la résistance aux infections. Cependant, ces suspicions épidémiologiques ne sont pas confirmées par les études expérimentales.

Ces études ont été réalisées principalement chez les rongeurs de laboratoire, le plus souvent chez le rat. Un effet néfaste sur la croissance est bien retrouvé, mais avec des posologies quotidiennes très élevées, supérieures à 500 mg/kg PV. Des effets antivitaminiques A et E ont aussi été observés, ainsi qu'une action hypothyroãdienne qui s'expliquerait par la perturbation du métabolisme de l'iode.

Ces effets défavorables ont été également mis en évidence chez diverses spèces d'animaux domestiques, avec une concentration dans la ration nettement supérieure cependant à celle que l'on peut relever sur le terrain dans le contexte de pollution de l'environnement que nous connaissons. Chez les ruminants, la part de l'eau d'abreuvement dans l'apport de nitrate est très minoritaire par rapport à celle de la ration fourragère. Une augmentation discrète de sa concentration ne modifie pas de façon sensible l'apport global. De plus, cet apport étant fractionné, il ne conduit pas à une résorption importante de nitrites en raison de leur réduction subséquente en ammoniaque et protéines par la microflore ruminale. Si les ruminants représentent une population à risques en matière d'intoxication aiguë, ils semblent en revanche être peu concernés par les effets à long terme.

Les volailles tolèrent également une concentration élevée dans la ration ou l'eau de boisson. C'est chez le porc que la tolérance semble moins bonne, et la pollution de l'eau est parfois mise en cause dans le développement des infections urinaires. Un éventuel effet cancérogène n'a jamais été envisagé à partir d'observations chez les espèces de rente; ce n'est pas une préoccupation des vétérinaires, car la courte durée de vie de ces animaux ne permettrait vraisemblablement pas son expression s'il devait se manifester.

Afin d'apporter une contribution à la connaissance des effets des nitrates à moyen et long terme, le Laboratoire de Toxicologie de l'ENVN a conduit (de 1990 à 1995) des études expérimentales chez le lapin. Plusieurs lots d'animaux ont été abreuvés pendant des périodes d'environ 6 mois, avec de l'eau renfermant de 120 à 600 mg de nitrate par litre. Les animaux ont fait l'objet d'examens approfondis portant en particulier sur la croissance, la reproduction, la teneur en vitamine A hépatique, le fonctionnement de la thyroïde, la réponse immunitaire. Globalement, les essais ont révélé la bonne tolérance des lapins aux concentrations testées.

Il faut souligner cependant les difficultés particulières d'évaluation de la toxicité de l'ion nitrate. En effet, l'extrapolation des résultats expérimentaux aux conditions d'exposition réelles, ne permet pas de tenir compte de l'intervention des microorganismes contaminant éventuellement le substrat alimentaire et conduisant à l'apparition de nitrite toxique. D'autre part, les données expérimentales concernant l'effet methémoglobinisant chez les nouveau-nés animaux sont malheureusement peu utiles pour évaluer le risque pour le nourrisson car il semble bien que celui-ci soit plus sensible que les espèces animales disponibles pour les essais.

Enfin, les essais conduits chez le rat, de loin les plus nombreux, sont parfois remis en cause pour estimer le risque chez l'Homme, en raison de la faible élimination salivaire de nitrate/nitrite chez cette espèce contrairement à ce qui est observé chez l'Homme.

Au bilan, on peut considérer que les effets néfastes de l'ion nitrate ne se manifestent chez les animaux domestiques qu'à des posologies élevées, ce qui conduit à tolérer une teneur en nitrate dans l'eau d'abreuvement des animaux de rente nettement supérieure à la CMA de l'eau potable, les propositions allant jusqu'à 450 mg/l.

Cette teneur peut être acceptable dans l'eau de boisson des animaux, mais se révèle en revanche très dangereuse pour d'autres espèces animales, celles dont c'est le milieu de vie, en particulier les amphibiens.

Acute nitrate toxicity is well known in veterinary medicine, but circumstances are not the same as in human. Indeed, methemoglobinemia is observed essentially in adult ruminant, above all in cattle, after consuming nitrate containing forage (above 5000 ppm /MS), rarely after contaminated water ingestion. The anatomy and microflora of ruminant animals allows the in vivo reduction of nitrate to nitrite and methemoglobinemia fomation occurs rapidly. But very young cattle, contrary to infants, are not particulary vulnerable and milk replacer can be prepared with high nitrate water without toxic effects. This is probably on account of enzyme activity which allows methemoglobin reduction in calf erythocytes. In other species, risk for newborns is not a problem because they are given mother milk, which is very poor in nitrate.

On the other hand, mild and long term effects of high nitrate food or water are still not clearly defined. On the field, detrimental effects on growth, fertility or immune defences were observed in livestock drinking water containing several hundred mg/L nitrate. However, these epidemiological suspicions are not confirmed by experimental studies. These studies have been conducted principaly in laboratory rodents, often in the rat. Decreased weight gain has been noted, but with high dosages, above 500 mg/kg/d. Hypovitaminosis A and E has been described, as also a impairment of thyroid function, which could be related to disturbance of iodide metabolism. These harmful effets have also been related in various domestic species, but at nitrate levels in diet really above those one can observe actually in environmental pollution. For ruminants, drinking water brings much less nitrate than do forages. A slight increasing of nitrate concentration in water don't lead to perceptible increase in whole intake. Moreover, this intake is divided, and therefore don't lead to large resorption of nitrites, which are reduced in ammonia and proteins by digestive microflora. In fact, cattle is very susceptible to acute intoxication but not to long term hazards. Poultry tolerate also high levels of nitrate in drinking water or food. But pigs should be more sensitive and high nitrate water could promote urinary infections.

Nitrate ingestion has never been involved in the aetiology of cancer in livestock, but cancer is very rare in these species, which are slaughtered after very short life.

In order to contribute to the knowledge of chronic nitrate toxicity, the Laboratory of Toxicology of ENVN conducted (for 1990 to 1995) experimental studies in rabbits. Several groups of animals were supplied for about 6 months with water containing 120 to 600 mg/L nitrate. Growth, reproduction, liver vitamin A stores, thyroid function, immune response were followed. No detrimental effect was observed.

Evaluation of nitrate toxicity is however difficult, because experimental results don't take into account microorganisms which can be present in water or food, and which are able to reduce nitrate to nitrite. Moreover, these studies are not interesting in order to evaluate risk for baby, who should develop methemoglobinemia more quickly than animal species. In other respects, studies in rat with the object of risk assessment in human are sometimes controverted, because elimination of nitrate/nitrite in saliva is much lower in rat than in human.

In domestic animals, it is possible to tolerate nitrate concentration in drinking water higher than what is accepted in human. Proposed values can reach 450 mg/L.

This level is acceptable for drinking water but could be very dangerous for animals wich live in water, especially amphibians.

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- Nitrate toxicosis in beef and dairy cattle herds due to contamination of drinking water an whey. Vet Human Toxicol 39, 296-298

C’est à partir des substances minérales dissoutes dans l’eau que les algues synthétisent leurs tissus. Du point de vue de la structure, le carbone est le composant principal, venant bien sûr après l’hydrogène et l’oxygène. Mais c’est le phosphore qui, en conditions naturelles, est le tout premier nutriment à faire défaut pour assurer la synthèse de nouveaux tissus., avant l’azote et le carbone. Le phosphore est dit « facteur limitant », notion empruntée à l’agronomie. C’est également le facteur de maitrise puisque c’est en agissant sur lui qu’il est possible d’augmenter ou de réduire les proliférations algales.

En déversant dans le réseau hydrographique des quantités considérables de phosphore, les activités humaines, qu’elles soient domestiques, industrielles ou agricoles, lui font perdre son statut de facteur limitant au profit de l’azote. Cette situation de carence azotée stimule la prolifération d’algues particulières (cyanobactéries) capables de fixer l’azote moléculaire dont l’atmosphère constitue une réserve quasi inépuisable. Une fois métabolisé cet azote se retrouve dans le milieu aquatique et participe à son fonctionnement au même titre que les autres apports. D’autres espèces cyanobactériennes vont également se développer en raison cette fois-ci de leur aptitude à proliférer dans les conditions d’éclairement réduit qu’entraîne la prolifération algale, toutes espèces confondues.

Outre leurs remarquables facultés d’adaptation, les cyanobactéries ont une taille, une consistance et une toxicité qui empêchent les prédateurs potentiels (zooplancton herbivore) de les consommer. Elles finissent donc par dominer le peuplement algal modifiant le fonctionnement du réseau trophique au point de nuire aux divers usages attendus de l’eau : le développement de conditions anoxiques entraîne l’élimination de toutes les formes supérieures de la vie, à commencer par les poissons de qualité (salmonidés), l’anoxie de l’interface eau/sédiment entraîne la réduction des composés du fer et le relargage du phosphore qu’ils piégeaient lequel vient s’ajouter aux apports du bassin versant pour intensifier le processus de dégradation, l’envahissement de la colonne d’eau par les cyanobactéries pose de gros problèmes de qualité d’eau, la présence de toxines cyanobactériennes n’étant pas des moindres.

Cette inéluctable dégradation en réponse à la pollution par les phosphates se manifeste d’autant plus intensément que le caractère stagnant des eaux est prononcé. Il ne faudrait cependant pas utiliser cette influence primordiale de la stagnation du milieu pour réserver un traitement préférentiel à des zones dites « vulnérables », abandonnant le reste du territoire à une pratique de la déphosphatation à l’économie. En effet, l’extrème solidarité du réseau hydrographique fait que de telles mesures discriminatoires ne peuvent qu’engendrer la généralisation de la dégradation des eaux stagnantes ou ralenties selon un gradient amont/aval, l’aval ultime étant la mer.

En conditions fortement anthropisées, l’azote étant facteur limitant des proliférations algales, leur augmentation peut être obtenue en ajoutant de l’azote, certes, mais aussi du phosphore du fait de l’apport automatique de l’azote manquant par les cyanobactéries fixatrices d’azote. Quant à vouloir ramener les proliférations algales au voisinage de ce qu’elles étaient avant la pollution par les phosphates (quand le phosphore était limitant), seule peut y arriver une réduction du phosphore, vouloir intervenir sur l’azote nécessiterait de le rendre plus limitant que le phosphore à un niveau de concentrations proche du naturel. Sans doute la pollution par les phosphates fait-elle de l’azote le facteur limitant, mais c’est toujours le phosphore qui est le facteur de maitrise.

Lutter contre les nitrates pour résoudre le problème de l’eutrophisation est donc une solution à la fois pratiquement impossible (nécessité de rendre l’azote plus limitant que le phosphore au voisinage des concentrations naturelles), écologiquement dangereuse (stimulation des cyanobactéries), techniquement inefficace (réinjection automatique par les cyanobactéries de l’azote que l’on s’efforce d’éliminer) et rationnellement indéfendable (on propose de lutter contre la pollution par les phosphates en traquant les nitrates !)

Non seulement les nitrates ne sont pas la bonne cible mais leur présence contribue à traiter deux conséquences néfastes de la pollution par les phosphates : leur azote remonte le rapport N/P empêchant ainsi l’apparition des fixatrices d’azote, leur oxygène entretient l’oxydation des composés du fer à l’interface eau/sédiment empêchant ainsi le relargage du phosphore associé.

En fait, si l’azote entraîne des nuisances dans les milieux aquatiques, ce n’est pas pour son rôle « eutrophisant » à l’état nitrique mais pour sa toxicité à l’état ammoniacal. En effet, en plus de la consommation d’oxygène qu’entraîne la nitrification de l’azote ammoniacal, celui-ci est toxique sous sa forme non dissociée NH₃. En conditions naturelles, les risques de toxicité sont très faibles car les concentrations d’azote ammoniacal le sont également. Par contre, en conditions anthropisées, les risques augmentent considérablement par suite des multiples déversements d’effluents peu ou pas traités contenant cette forme d’azote, dans les urines notamment. De plus, l’accroissement du pH favorisant la forme NH₃toxique, les eaux les plus touchées sont celles où la photosynthèse, consommatrice de CO₂, est la plus active, donc celles où les algues proliférent le plus et par conséquent celles où le phosphore est le plus abondant.

Pour en savoir plus

BARROIN G., 1985 - La dénitrification en milieu lentique. - Rev. fr. sci. eau, 4, p. 79-92. (251)

BARROIN G., 1990 - La pollution des eaux par les phosphates. La Recherche, 221, p. 620-627. (367)

BARROIN G., 1991 - La réhabilitation des plans d'eau. La Recherche, 238, p. 1412-1422. (414)

BARROIN G., 1995 - Les phosphates ou comment manipuler la science. La Recherche 281, 56-60.

BARROIN G., DORIOZ, J.M., DURAND P., MEROT P., 1997 - Entraînement de l’azote dans les eaux de surface et conséquences sur les écosystèmes aquatiques. Colloque «maîtrise de l’azote dans les agrosystèmes » Reims, 19-20 nov. 1996. Ed. INRA. Les Colloques n° 83, 39-53.

Assises Internationales ENVIROBIO: 13-14 novembre 2000 – Paris

Dr. J.L. Burgaud, NicOx, B.P. 313, 1900 route des crêtes, 06906 Sophia-Antipolis.

NicOx est une société biopharmaceutique qui développe de nouveaux produits avec des profils de sécurité et d’efficacité améliorés par l’exploitation des propriétés de monoxyde d’azote (NO). L’approche innovante de NicOx consiste à exploiter les propriétés bénéfiques du NO en greffant sur des médicaments existants une structure libérant de l’oxyde nitrique dans les tissus et le sang de façon prolongée et contrôlée. L’objectif du développement de ces molécules chimiques est triple:

- diminuer les effets secondaires des anti-inflammatoires non-stéroïdiens (AINS) notamment au niveau du tractus gastro-intestinal et rénal,

- améliorer le profil pharmacologique de ces substances, et enfin,

- obtenir de nouveaux effets pharmacologiques et donc de nouvelles applications thérapeutiques.

L’exposé portera sur la présentation des avantages d’une telle stratégie en s’appuyant sur les résultats obtenus avec le produit phare de NicOx, la nitro-aspirine ou NCX 4016.

Cette nouvelle entité chimique est un dérivé nitré de l’Aspirine. La molécule est composée de l’acide acétylsalicylique, d’un pont chimique estérifié et d’une entité capable de libéré du NO (ONO₂) par hydrolyse enzymatique du pont chimique (1). Cette structure ne peut donc en aucun cas être considéré comme une pro-drogue, le NO comme l’aspirine possédant une activité pharmacologique. On parle donc d’une nouvelle entité chimique.

Le premier aspect de cette présentation concernera la pharmacocinétique du produit. La demi-vie de l’acide acétylsalicylique étant très courte et le produit étant difficilement dosable, nous suivons donc le devenir du NCX 4016 en dosant au niveau sanguin le taux de ces 2 principaux métabolites, l’acide salicylique et les nitrites/nitrates. Nous observons, quelque soit le composé dosé, une homologie dans les tracés. En effet, les pics sériques du salicylate et des nitrates apparaissent dans un délai de 6 heures tandis que les nitrites sont absents (2). On note ici l’importance de la libération lente du ONO₂, qui évite une augmentation rapide du taux plasmatique de NO, ce qui aurait pour conséquence, comme nous le verrons plus loin, d’entraîner une vasodilatation massive responsable d’une hypotension.

Afin de vérifier que le ONO₂ libère correctement du NO, nous avons mesurer ex vivo le taux de GMP cyclique intraplaquettaire. Nous constatons ici que le taux augmente lentement, mimant parfaitement les courbes des nitrates.

Nous avons bien entendu comparer la cinétique du NCX 4016 à celle d’un donneur conventionnel de NO, la S-nitroso-N-acétyl-penicillamine sur des monocytes humains. Nous avons ainsi constaté et confirmé la libération lente et prolongée du NO pour le NCX 4016 tandis que le SNAP montre une libération beaucoup plus rapide et beaucoup plus massive de NO. Cette constatation s’avère confirmée que l’on regarde l’évolution du taux des nitrates, du taux de GMP cyclique intracellulaire ou l’apparition intracellulaire de fluorescence en utilisant la technique du DAF-2DA (3).

Des études de pharmacocinétique nous ont également permis d’élucider une partie du processus métabolique propre à nos composés. L’administration orale d’une dose unique de 200 mg/kg de NCX 4016 chez le rat a permis de montrer la formation de HB-NO (nitroso-hémoglobine); cette formation étant maximale à 6 heures et disparaissant après 24 heures.

La concentration maximale de salicylates atteinte est de 8 mg/ml. Cette concentration plasmatique est dans tous les cas supérieure aux concentrations effectives du composé obtenues dans différents modèles expérimentaux.

Au niveau du tractus gastro-intestinal, de nombreuses études ont démontré que l’utilisation d’AINS représentait un facteur d’aggression notamment pour la muqueuse gastrique. Ceci s’explique par le fait que les AINS inhibent totalement la synthèse de prostaglandines au niveau de l’estomac. Il en résulte une diminution de flux sanguin engendrant ainsi une baisse de la production de bicarbonate et du mucus. Il en découle obligatoirement une lésion de la muqueuse gastrique (4).

Bien que les NO-AINS inhibent la synthèse de prostaglandines, ils permettent, par l’effet du NO, de maintenir la sécrétion de bicarbonate et de mucus, évitant ainsi la lésion de la muqueuse gastrique. Cette protection du tractus gastro-intestinal se retrouve également lorsque nous comparons les effets des NO-AINS avec ceux des inhibiteurs spécifiques de la COX-2 chez l’animal âgé, les NO-AINS démontrant des effets plus bénéfiques (5).

Le deuxième objectif du développement des NO-AINS est d’améliorer les effets pharmacologiques des produits. Nous avons donc comparer les effets pharmacodynamiques de NCX 4016 à ceux de l’aspirine. Ces études ont porté sur les effets anti-inflammatoires, analgésiques, anti-thrombotiques et anti-prolifératifs de ces deux composés. Dans tous les cas la nitro-aspirine s’est révélé un composé plus efficace que l’aspirine:

- dans un modèle expérimental d’inflammation in vivo, le NCX 4016 montre un effet anti-inflammatoire 10 fois supérieur à celui du composé natif,

- le NCX 4016 a montré également une plus grande efficacité que l’aspirine à prévenir le thromboembolisme chez la souris. Cet effet s’explique en majorité par l’action du NO au niveau des plaquettes, une augmentation prolongée du taux de GMP cyclique dans celles-ci étant responsable de l’inhibition de l’agregation et de l’adhesion plaquettaire, l’aspirine étant dépourvue d’activité sur l’adhésion plaquettaire.

En résumé, la nitro-aspirine joue donc un rôle primordial au niveau du système cardio-vasculaire. De part ses actions combinées aspirine et NO, elle permet d’inhiber la vasoconstriction, la dégranulation des mastocytes, l’agrégation et l’adhésion plaquettaire, la migration des neutrophiles et des lymphocytes, l’infiltration des macrophages et enfin diminuer le chimiotactisme pour les neutrophiles (6).

De plus, des études complémentaires ont permis de confirmer que le NCX 4016 inhibe la prolifération des cellules musculaire lisses vasculaires, démontrant ainsi un intérêt thérapeutique potentiel pour le traitement de la sténose après angioplastie. Ce dernier phénomène trouve une explication dans la faculté que possède NO-aspirine à inhiber la translocation nucléaire du facteur de transcription NF-kB (7).

Mais le portefeuille de produits en développement chez NicOx ne s’arrête pas à la nitro-aspirine. Il comprend des futurs médicaments pour le traitement de nombreuses pathologies. On compte parmi ces produits le HCT 1026, un dérivé nitré de l’AINS flurbiprofène, qui est en essai clinique de phase II pour deux affections fréquentes ches la femme ménopausée, l’incontinence urinaire et l’ostéoporose. Une première étude pilote de phase II a démontré une amélioration des paramètres urodynamiques et des symptomes cliniques associés à une vessie neurogène. De plus, le développement clinique d’une formulation pour usage local du HCT 1026 pour des affections dermatologiques telles que le psoriasis et la dermatite atopique est en cours. Le NCX 1015 est un dérivé nitré du stéroïde prednisolone. Cette molécule est en phase de développement pour le traitement des entéropathies inflammatoires chroniques. Il a été démontré sur des modèles animaux que le NCX 1015 est plus efficace dans la diminution de l’inflammation des tissus que les stéroïdes conventionnels. De plus, NicOx évalue actuellement NCX 1020 et d’autres NO-stéroïdes pour le traitement des maladies respiratoires telles que l’asthme. Des résultats préliminaires ont démontré, sur différents modèles animaux, une plus grande activité bronchodilatatrice du NCX 1020 comparativement au composé parent.

On compte parmi les produits phare de NicOx le NCX 701, dérivé du paracetamol. La greffe d’un molécule de monoxyde d’azote à ce produit permet de le doter d’une activité analgésique plus puissante, ce produit possède en outre une activité anti-inflammatoire contrairement au produit parent. De plus, des études précliniques ont démontré une réduction de la toxicité hépatique et rénale (8).

Tous ces exemples montrent l’intérêt grandissant de l’utilisation du monoxyde d’azote dans l’industrie pharmaceutique. Les produits développés par NicOx sont un exemple de l’utilisation possible des nitrates pour obtenir un effet bénéfiques sur l’organisme. Cette notion est la parfaite application au niveau industriel de la découverte des Professeurs Ignarro, Murad et Furchgott, Lauréat du Prix Nobel en 1998 pour leur recherche sur le monoxyde d’azote comme importante molécule messager dans l’organisme.

References

1- NO-aspirins, a class of new anti-inflammatory and antithrombotic agents.

Del Soldato P. Sorrentino R. and Pinto A.
Trends Pharmacol. Sci. 1999: Aug.: 20(8). 319-323

2- EPR analysis of nitrosyl-hemoglobin, an unequivocal marker of nitric oxide release from NO-NSAIDs in vitro and in vivo.

Aldini G., Carini M., Stefani R., Maffei Facino R., Rossoni G. and Del Soldato P.

Presented at the 11^th International Conference on Advances in Prostaglandin and Leukotriene Research. Florence, Italy. June 4-8, 2000.3- No-Aspirin inhibits IL-1b-converting Enzyme (ICE) and Prevents IL-1b, IL-I8 and IFNg release from Endotoxin-stimulated Human Peripheral Blood Monocytes.

Fiorucci S., Santucci L., Del Soldato P., Morelli A.

J. Immunol., 2000. In Press.

4- Lack of gastric toxicity of nitric oxide-releasing aspirin, NCX 4016, in the stomach of diabetic rats.

Tashima K., Fujita A., Umeda M., Takeuchi K.

Life Sciences, 2000. Aug. 18; 67(13): 1339-52

5- Nitric Oxide: implications for therapeutic breakthroughs.

Burgaud, J.L., Del Soldato P.

ID Weekly Highlights, Current Drugs Ltd., August 2000

6- Myocardial protection by the nitroderivative of aspirin, NCX 4016: in vitro and in vivo experiments in the rabbit.

Rossoni G., Berti M., De Gennaro Colonna V., Bernareggi M., Del Soldato P. and Berti F.

Ital. Heart J. 2000. Feb. 1(2); 146-55.

7- NO-aspirin protects from T cell-mediated liver injury by inhibiting caspase-dependent processing of Th1-like cytokines.

Fiorucci S., Santucci L., Antonelli E., Distrutti E., Del Sero G., Morelli O., Romani L., Federici B., Del Soldato P., Morelli A.

Gastroenterology 2000. Feb; 118(2): 404-21

8- Nitroparacetamol exhibits anti-inflammatory and anti-nociceptive activity.

al-Swayeh OA., Futter LE., Clifford RH. and Moore P.K.

Br. J. Pharmacol. 2000. 130: 1453-1456

Pour étudier les effets pharmacologiques, pharmacodynamiques et pharmacocinétiques de ses produits, NicOx collabore dans le monde entier avec des chercheurs reconnus pour leur compétence qui guident et conseillent la société dans ses programmes de recherche et de développement. Parmi ces nombreux collaborateurs, plus de cent au total, nous pouvons noter les Professeurs Ignarro* (UCLA Medical College, USA), Samuelson* (Karolinska Institute, Sweden), Moncada (Wolfson Institute, UK), Flower (William Harvey Research Insitute, UK), Hawkey (University Hospital Nottingham, UK), Paoletti (University of Milan, Italy), Emery (University Hospital Leeds, UK), Wallace (University of Calgary, Canada), Benjamin (Queen’s College Londres, UK). * Lauréat du Prix Nobel.

NicOx is a biopharmaceutical company developing innovative new drugs designed to have improved safety and efficacy profiles through the application of the recently discovered properties of nitric oxide (NO). The Company is at the forefront in the research and development of nitric-oxide-releasing therapeutics. The Company is targeting major pharmaceutical markets including pain and inflammation and a broad range of other therapeutic categories, including cardiovascular diseases, respiratory diseases, inflammatory bowel disease, urinary incontinence, osteoporosis, Alzheimer’s disease and glaucoma.

Nitric oxide, a compound that usually takes the form of an odorless, colorless gas, is synthesized in the cells of mammals and is believed to be involved in a broad range of biochemical and physiological reactions. Scientific research, including recent groundbreaking studies for which three scientists (including a member of the Company’s Scientific Advisory Board) were awarded the 1998 Nobel Prize in Physiology or Medicine, has shown nitric oxide not only to convey biochemical signals that result in a wide spectrum of effects on different biological systems, including the cardiovascular, central nervous and immune systems, but also to act as an important regulator of general cellular processes. These findings indicate the potential for nitric oxide to play a role in the discovery of breakthrough drugs for a wide variety of diseases that may not only have fewer side effects than existing products, but also may be more effective. Using its proprietary technology, the Company seeks to exploit this potential through the development of nitric-oxide-releasing therapeutics.

The Company’s innovative approach harnesses the beneficial properties of nitric oxide by grafting a nitric-oxide-releasing structure onto existing drugs. By beginning with a conventional drug whose pharmacological properties are well known, the NicOx benefits from an existing base of knowledge from which to design preclinical and clinical development studies. This enables evidence of efficacy and reduced side effects to be confirmed very early in clinical development, and in some cases by the end of Phase I, thereby shortening the overall product development cycle. In preclinical tests, the Company’s drug candidates have shown dramatically reduced side effect profiles compared with the parent drugs, and in many cases show the potential to be more effective. Furthermore, the Company has already achieved proof of principle in humans for one of its lead nitric-oxide-releasing compounds. At present, three drug candidates have advanced to human clinical trials.

The Company is focusing on the development of nitric-oxide-releasing derivatives of aspirin and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as flurbiprofen. More than 30 million people worldwide consume NSAIDs every day. The major drawback of NSAIDs and aspirin is their tendency to cause gastrointestinal damage. Gastrointestinal toxicity from NSAIDs is estimated to be the most frequent drug side effect in the United States, and almost 25% of the anti-ulcer drug market has been estimated to be aimed at treating this side effect. The recently introduced COX2 selective NSAIDs have gained significant market share, but concerns remaining regarding the theoretical side-effects of the selective inhibition including renal toxicity, edema, hypertension and thrombosis. Preclinical research by the Company has shown that grafting a nitric-oxide-releasing structure onto aspirin and a range of NSAIDs may greatly reduce their gastrointestinal, renal and cardiovascular adverse effects and increase their safety in frequent use conditions and situations of pre-existing gastrointestinal damage. The Company’s preclinical research also suggests that the anti-thrombotic properties of nitric oxide may significantly enhance the effectiveness of aspirin in the prevention of cardiovascular disease. Furthermore, the Company’s nitric oxide releasing NSAIDs may be suitable for new indications including incontinence, osteoporosis, Alzheimer’s disease and prevention of colon cancer.

The Company is developing NCX 4016 (NO-aspirin) for the treatment of cardiovascular disease and pain and inflammation. Its IND (Investigational New Drug) application was approved by the FDA (Food and Drug Administration), allowing for future clinical trials of the compound in the United States.

The most advanced of these drug candidates is HCT 1026 (NO-flurbiprofen), currently in phase II clinical development for urinary incontinence and Paget’s disease, a disease that can lead to osteoporosis. In parallel, the Company is developing a broad range of uses for other nitric-oxide-releasing NSAIDs as new treatments in important pharmaceutical growth markets, including asthma, inflammatory bowel disease, urinary incontinence, osteoporosis, Alzheimer’s disease and glaucoma. The Company plans to advance clinical development of these drug candidates on its own, with a view to negotiating further strategic partnerships based on such drugs at later stages in the development process.

Other important drug candidates in the Company’s pipeline include nitric-oxide-releasing drugs to treat a range of indications, including nitric oxide releasing steroid derivatives for the treatment of inflammatory bowel disease and respiratory diseases such as asthma. The Company has also recently advanced into the development of the lead compounds NCX 2216 from a new series of nitric oxide releasing anti-inflammatory compounds with potent anti-oxidant properties for the treatment of Alzheimer’s disease. For the treatment of asthma, the Company is developing NCX 950, a nitric oxide releasing beta agonist. NCX 904, a nitric oxide releasing beta antagonist is in development for the treatment of glaucoma. In addition to the drug candidates already in its development pipeline, the Company believes its nitric-oxide-releasing technology has potential applications in far-ranging fields that the Company has identified for future study.

Atelier 2

Monsieur Jacques POULET

Union des industries de la fertilisation

Fertilisation et environnement : Union des Industries des fertilisants et Amendements

Atelier n° 2 : Fertilisation et environnement. (Unifa).

Aujourd’hui, l’agriculteur est confronté à plusieurs défis. Le plus ancien, partagé par tous, et sûrement le plus important est de pouvoir vivre de son métier. Les politiques agricoles communes successives ont en général répondu à cette préoccupation. Par contre, la dernière « PAC », Agenda 2000, change complètement la donne. Il est prévu une baisse du revenu de l’agriculteur d’environ 15% sur les cinq ou six prochaines années. L’agriculteur doit donc repenser son métier en terme de compétitivité.

Le second challenge de l’agriculteur consiste à fournir des produits de qualité à des prix concurrentiels. Ce principe, qui semble être une exigence nouvelle des consommateurs, est en fait le moteur d’une agriculture de progrès qui a probablement conduit à certains des excès que nous connaissons aujourd’hui. La forte médiatisation des événements qui touchent actuellement l’agriculture (OGM, ESB, etc) a annihilé, chez le citoyen, tout jugement critique et rationnel au profit de réactions épidermiques et émotives. L’agriculteur doit communiquer pour faire connaître son métier.

Enfin, le dernier défi est peut-être né des succès que l’agriculteur a remportés sur les deux précédents. Auparavant « nourrisseur » de ces concitoyens, l’agriculteur devient « pollueur » de notre environnement. Etonnant pour une profession proche de la nature dont le crédo est de transmettre à la génération suivante un patrimoine (le sol, la ressource en eau, le cheptel, etc.) intact sinon amélioré. Désormais l’agriculteur doit prendre en compte l’impact de ses activités sur l’environnement.

La vie de l’industrie des fertilisants est très liée à cette évolution. Hier associée à la réussite de l’agriculture pour nourrir la planète et aux gains de compétitivité de notre secteur agricole, l’industrie des fertilisants se retrouve aujourd’hui au premier rang des accusés à travers l’utilisation des fertilisants minéraux. Les discours extrémistes de certains occultent totalement l’importance vitale pour notre agriculture d’une fertilisation minérale qui malgré toutes les hypothèses restera nécessaire. Les industriels, en relation avec les instituts techniques, ont donc mis en place des expérimentations et développé des outils de gestion de la fertilisation minérale. L’objectif est triple : optimiser l’utilisation de la fertilisation minérale, limiter les risques pour l’environnement et garder, voire améliorer la qualité de la production.

Cet atelier vous propose trois présentations succinctes, ayant pour thème principal l’azote, pour illustrer ces propos :

L’industrie des fertilisants, le cycle de l’azote, le bilan azoté.

Une agriculture durable va de paire avec l’utilisation des fertilisants minéraux azotés. Quel tonnage représentent ces fertilisants azotés ? Comment fabrique-t-on un fertilisant azoté ? Quelles sont les autres sources d’azote disponibles pour la plante ? Voici quelques-uns uns des points qui seront présentés avant d’avoir un aperçu rapide du cycle de l’azote en agriculture et du « bilan azoté » pour mieux comprendre toute la difficulté que représente la gestion de la fertilisation azotée. L’utilisation de plus en plus courante du « bilan azoté » accompagnée d’outils d’aide à la décision permet d’ajuster au mieux la fertilisation minérale aux besoins de la plante. Si malgré toutes les précautions prises, un accident climatique, phytosanitaire, etc, aboutissait à un reliquat d’azote élevé dans le sol, il existe des méthodes pour piéger ces nitrates et limiter le risque de transfert vers les nappes phréatiques.

Les outils de gestion de la fertilisation azotée : un exemple, le chlorophylomètre.

Pour minimiser le stock de nitrates dans le sol après la récolte, il faut raisonner sa fertilisation azotée. Cela consiste à alimenter sans excès la culture durant son cycle de végétation sans pour cela avoir une incidence négative sur son potentiel de rendement. L’objectif des outils de pilotage de la fertilisation azotée est de réduire le plus possible le reliquat azoté provenant des fertilisants minéraux. Ces outils mesurent la teneur en azote de la plante. L’outil présenté par Hydro Agri France est un chlorophylomètre (Hydro-N tester) capable d’aider l’agriculteur dans sa prise de décision en fonction du rendement optimal à atteindre mais aussi en fonction d’objectif de qualité du produit à récolter.

3. Un exemple de mesure pour limiter l’impact de la fertilisation azotée sur l’environnement : le bassin versant d’Aradé.

Depuis 1980, dans la région de Toulouse, un dispositif expérimental à grande échelle a été mis en place par Grande Paroisse, premier fabricant de fertilisants en France, en association étroite avec les agriculteurs: le bassin versant d’Auradé. Cette expérimentation a mis en évidence une relation de cause à effet entre pratiques des agriculteurs, pluviométrie et concentration en nitrates des eaux, et un lien entre structure géographique du terrain et dynamique de l’azote. Des mesures ont été retenues et appliquées sur l’ensemble du dispositif : des mesures préventives concernent la gestion des cultures et une conduite raisonnée de la fertilisation azotée et des mesures curatives consistent à aménager le paysage agricole pour réduire le risque de transfert de nitrates vers les eaux de surface.

MODULE 2 bis

NITRATES CYCLE BIOLOGIQUE ET ENVIRONNEMENT

Présidents de séance :

Monsieur FAVIER :

Ecole Supérieure Physique Chimie Industrielle - PARIS

Professeur Maria Elvira LOPEZ-MOSQUERA :

Ecole Polytechnique Supérieure Université de

St Jacques de Compostelle - LUGO

En utilisant le Saumon atlantique comme indicateur des relations entre les activités humaines et l'écosystème fluvial, un bilan de l'évolution de la qualité de l'eau des cours d'eau bretons à saumon est dressé dans une perspective historique sur une durée de près de six siècles, du XVème à la fin du XXème siècle. Ce travail a eu pour but de tester un des aspects de l'hypothèse d'une abondance passée extraordinaire du saumon dans cette province sous l'Ancien Régime, admise sans hésitation depuis le début du XXème siècle.

Il s'agit essentiellement d'un travail bibliographique, de culture scientifique, employant quelques résultats du milieu du XXème siècle concernant les pollutions d'activités anciennes, rouissage du lin et du chanvre, tanneries. Deux autres activités sont aussi prises en compte, les moulins à papier et les mines de plomb argentifère. Cette étude repose sur une méthode en quatre points incluant la dimension historique :

* les connaissances actuelles de l'écologie de l'espèce et de sa répartition en Bretagne, passée (au début du XVIIIème siècle) et présente, localisent l'étude quasi-exclusivement à la moitié occidentale de la péninsule armoricaine. Les fleuves côtiers de la moitié orientale, à l'exception du Couesnon, n'ayant pas été colonisés par le saumon.

* une approche transdisciplinaire, avec mise en concordance, dans le temps et dans l'espace, sur les bassins versants de ces cours d'eau, des travaux d'historiens, avec des documents bruts de l'époque, en y intégrant les mesures réglementaires.

* un retour systématique aux sources originales. Ce dernier point constitue le socle de cette étude. Il s'appuie sur les dépouillements des documents d'archives, d'ouvrages, de rapports officiels, d'articles.

C'est surtout la pollution provenant de la pratique du rouissage dans les cours d'eau et des effluents des mines de plomb argentifère qui est connue. Les pollutions issues des effluents des tanneries et des moulins à papier sont, aussi, comme le rouissage, des pollutions organiques et physiques, mais plus localisées. Ces quatre activités étudiées concernant l'ensemble des cours d'eau à saumon, sauf pour les tanneries qui ne se rapportent qu'au Finistère.

* elles se répartissent préférentiellement dans un large quart nord-ouest de la Bretagne et à l'est.

* elles montrent un accroissement depuis le XVème siècle, pour atteindre un apogée du milieu du XVIIIème siècle au milieu du XIXème siècle, et décliner ensuite, puis disparaître, à quelques décennies près, au milieu du XXème siècle.

L'hypothèse est émise d'une pollution croissante entre le XVème siècle et le milieu du XVIIIème siècle, d'un apogée de cette pollution jusqu'au milieu du XIXème siècle, en relation avec l'évolution économique de ces activités. La Bretagne a compté parmi les plus grandes provinces toilières de France et a même figuré à leur tête à la fin du XVIIIème siècle ; les mines de plomb argentifère sont une des plus importantes du royaume au cours de la seconde moitié du XVIIIème siècle. L'importance de la pollution est connue des contemporains : la couleur jaune de l'eau des rivières suite au rouissage, la mortalité des poissons et des hommes (dysenterie, saturnisme, pouvant expliquer la surmortalité bretonne observée à la fin du XVIIIème siècle), et la destruction de la végétation (les arbres morts à 15 m sur chaque rive en aval de l'effluent des mines de Basse-Bretagne).

Les mesures réglementaires ne concernent que le rouissage dans les cours d'eau. Elles existent depuis les coutumes (jusqu'au décret de 1958) et n'ont jamais été réellement appliquées. Le prix de vente plus élevé des toiles provenant du rouissage en eau courante, de meilleure qualité, a toujours constitué un élément prépondérant par rapport à la qualité de eau.

Une conclusion en trois points se dégage :

* Force est de constater que ce n'est pas la réglementation qui a entraîné, sinon l'arrêt, tout au moins une diminution de la pollution due au rouissage, mais l'arrêt de cette activité qui a conduit à l'absence de réglementation.

* L'abondance passée extraordinaire du saumon en Bretagne sous l'Ancien Régime est un mythe. Ceci s'appuie sur une quasi-stabilité des zones de production depuis le début du XVIIIème siècle et sur les pollutions croissantes mises en évidence principalement sur les fleuves côtiers bretons du quart nord-ouest et à l'est de la province.

* La césure du milieu du XXème siècle consacre la fin d'activités anciennes et le développement de quatre éléments, la croissance urbaine, la généralisation de l'adduction d'eau, l'intensification de l'agriculture, l'évolution des soucis d'hygiène de la fin du XIXème siècle vers les soucis de santé qui émergent à la fin du XXème siècle.

The Atlantic Salmon is used as an indicator of the links between human activities and the river ecosystem. This permits to sum up through nearly six centuries, from the 15^th to the end of the 20^th century, the evolution of the water quality of the Briton salmon rivers. This article aims at testing one of the aspects of the hypothesis concerning an extraordinary abundance of salmons in this area in the Ancien Régime, hypothesis that has been admitted, without check, since the beginning of the 20^th century.

Work is based on several scientific writings, and uses a few results of the middle 20^th century concerning pollution from ancient activities, retting of flax and hemp, tanning. Two other activities are also taken into account, production in paper water mills and argentiferous lead mines. This study lies on a four-point method that includes an historical dimension:

· What is known about the ecology of the species and its repartition in Brittany, passed (beginning of the 18^th century) and present focuses the study quite exclusively on the Western part of Brittany. Coastal rivers of the Eastern part _ except for the Couesnon river_ have not been colonised by the Salmon.

· An approach through different fields, linking both in space and time works of Historians on the water sheds of these streams with original documents, including statutory measures of that time.

· A systematic check back to the sources of data. That point represents the cornerstone of this study. It backs on reading recorded documents, books, official reports, and articles.

Pollution from retting in rivers and from producing argentiferous lead is well known. However, pollution from tanning and the one that derives from paper water mills is also an organic and physical pollution, but more localised. These four activities concern all of the Salmon streams, except for tanneries that were only found in the Finistère area.

· These four activities are mainly found in a large NorthWestern part and in the Eastern part of Brittany.

· They grew from the 15^th century up to the middle 18^th-middle 19^th centuries, and then fell to disappear in the middle of the 20^th century.

One hypothesis is that pollution grew between the 15^th century and the mid 18^th century. Pollution reached a peak until the mid 19^th century because of the economic evolution of these activities. Brittany used to be one of the biggest areas that produced canvas in France and was even heading at the end of the 18^th century. Brittany’s argentiferous lead mines are among the biggest ones of the whole kingdom in the second half of the 18^th century. The importance of pollution was well known at that time. Proves were the yellow colour given to the river water by retting, fish and people mortality (because of dysentery, saturnism, that could explain the high mortality in Brittany at the end of the 18^th century), and the destruction of vegetation (e.g. dead trees were found up to 15 m from both banks downstream of the sewage of Basse-Bretagne mines.

Statutory measures only concern retting in streams. They had been existing since the French coutumes (local rules from the Middle Age until the 1958 decret) and have never really been applied. The higher sale price of canvas retted in running water, thus giving a better quality, has always been determining in the quality of water.

A three-point conclusion arises:

· Regulation did not entail the stop or at least less pollution from retting, but the death of this activity did entail a situation of no regulation.

· The presumed passed abundance of salmons in Brittany in the Ancien Régime is a myth, based on a quasi-stability of the production areas since the beginning of the 18^th century and on the growing pollution observed mainly on the coastal rivers in the North West and on the East of Brittany.

· The mid 20^th century represents a break with the end of ancient activities and the development of four elements, i.e. urban growth, a generalised water adduction, an intensified agriculture, the evolution of hygienic cares at the end of the 19^th century and a growing interest in health considerations at the end of the 20^th century.

A study of the organisation and functioning of a hydrogeological system in a fractured aquifer in crystalline rocks was undertaken in the Kerharo river basin in Brittany (Finistère, France). Observations and measurements were made from the scale of the river basin to that of a 0.35 km² experimental perimeter with more than 50 water sampling points. A several method approach revealed some aspects of the geometry of the aquifer (heterogeneity, anisotropy, connectivity, partitioning) and provided information about the hydrodynamic situation and especially the hydrochemical functioning of the aquifer. Redox and hydrodynamic conditions control vertical stratification through the position of the oxido-reduction zone between a thin oxidizing zone containing nitrate and a nitrate-free reducing zone. The bacteriological approach suggest that the site potential in terms of denitrifying processes would be apparently associated to the heterotrophic part of the bacterial communities. The autotroph fraction (Thiobacillus denitrificans) is found at lower densities and is merely linked to surfaces. However, the occurrence of these two types of microflore in all of the six studied systems confirm that denitrifying processes can develop provided environmental conditions allow. The possibility of extension of this scheme to others aquifers is examined.

Key words : Fractured medium, nitrate, denitrification, denitrifying bacteria, hydrogeochemical zoning, Finistère, Brittany.

Monsieur Pierre CASTILLON et Monsieur Gilles THEVENET

ITCF – Institut Technique des Céréales et des Fourrages – PARIS

Rôle des systèmes de cultures dans le transfert

de nitrate vers les aquifères récepteurs

Dans tous les écosystèmes, la dynamique de l'azote conduit à la présence de nitrate dans les sols. Qu'il provienne des engrais minéraux ou de la minéralisation de l'azote organique, une partie peut être transférée vers les eaux de surface ou souterraines qui approvisionnent les captages d'eau potable.

Faibles en général dans les écosystèmes naturels (forêts, pelouses de montagne … etc) les transferts de nitrate, du sol vers les aquifères récepteurs, sont parfois importants dans les sols cultivés et d'autant plus que l'agriculture est intensive. Celle ci utilise souvent des quantités importantes de fertilisants azotés qui se sont ainsi vu imputer la responsabilité principale de l'accroissement des teneurs en nitrate des eaux. Le mot engrais est alors devenu synonyme de pollution. Or l'azote minéral présent dans le sol à la récolte des cultures, et donc susceptible d'être entraîné par les eaux de drainage ou de ruissellement, ne contient qu'une très faible part des engrais minéraux apportés, sauf lorsque la fertilisation est excessive par rapport aux stricts besoins des cultures. Néanmoins la réglementation qui s'applique aux zones vulnérables depuis la mise en œuvre de la directive nitrate concerne principalement les pratiques de fertilisation azotée des cultures.

Les fuites de nitrate des parcelles agricoles sont en réalité beaucoup plus le fait des systèmes de cultures pratiqués que de leur fertilisation azotée. La nature des espèces cultivées et leur mode de succession dans les rotations culturales déterminent l'époque et la durée des intercultures au cours desquelles l'ion nitrate présent, ou produit dans le sol par la minéralisation des matières organiques, est susceptible d'être drainé. Dans un contexte pédoclimatique donné, la quantité de nitrate transférée vers les aquifères est d'autant plus élevée qu’est longue la durée de la saison pluvieuse pendant laquelle le sol est dépourvu de couvert apte à y puiser de l’azote .

Toutefois indépendamment de l'époque et de la durée du cycle végétatif de la culture, la quantité d'azote nitrique perdue par un sol cultivé, c'est à dire non récupérable par les cultures ultérieures, peut aussi varier selon l'espèce cultivée en relation avec certaines de ses caractéristiques : profondeur d'enracinement, aptitude à puiser l'eau dans le sol, teneur en azote des résidus de culture … etc. C'est ainsi que les pertes d'azote sont en général beaucoup plus élevées après un maïs qu'après un sorgho dont les cycles végétatifs sont pourtant concomitants. Il en est de même pour les cultures de pois et d'orge de printemps, les fuites d'azote nitrique étant généralement plus importantes après la culture de pois qui ne reçoit jamais de fertilisation azotée.

L'occupation permanente du sol par un couvert végétal constitue la solution idéale pour limiter au minimum les pertes d'azote des systèmes cultivés. La prairie qui en est l'exemple type n'exclut pourtant pas le drainage du nitrate , en quantités parfois importantes. Ceci est particulièrement vrai pour la prairie pâturée dont une part de l'azote que les animaux y restituent au cours du pâturage est inévitablement drainé. L'importance des pertes d’azote dépend beaucoup dans ce cas du mode de gestion de la prairie et tout particulièrement de la part respective de la fauche et de la pâture, ainsi que du chargement d’animaux au pâturage permis par la croissance de l’herbe. Dans les prairies de graminées , la suppression de la fertilisation azotée substituée par l'introduction d'une légumineuse ne modifie en rien le phénomène.

Quelle que soit la nature de l'écosystème, le transfert de nitrate vers les aquifères récepteurs est donc inéluctable. Il a pour origine principale la matière organique du sol dont la minéralisation produit d’autant plus de nitrate que le stock d’azote organique dans le sol est important. Dans les écosystèmes cultivés, la substitution à la fertilisation azotée de solutions apparemment plus "écologiques", telles que l'introduction des légumineuses dans le système de culture, ne modifie pas toujours dans le sens souhaité le phénomène.

In all ecosystems, nitrogen transformations lead to the presence of nitrate in soils. Whether it originates from mineral fertiliser or from the mineralisation of organic nitrogen, part of it may be transferred into surface or underground waters which supply drinking water catchments.

Although generally low in natural ecosystems (forests, moors, mountain pastures etc,) nitrate transfers from the soil into aquifers are sometimes considerable in cultivated soils and especially when farming is more intensive. In this case large amounts of nitrogen fertilisers are used and these are therefore blamed for most of the increase in the nitrate content of the water. The word fertiliser has thus become synonymous with pollution. Yet the mineral nitrogen present in the soil when the crop is harvested, and thus likely to be transported in drainage water or runoff only contains a very small proportion of the mineral fertiliser applied, except when the fertilisation is excessive compared with the strict requirements of the crops. Nevertheless the regulations which have applied to the vulnerable zones since the introduction of the Nitrate Directive in 1991 are mostly concerned with the practice of nitrogen fertilisation of crops.

The losses of nitrate from agricultural fields are in reality more the result of the cropping systems practised than of their nitrogen fertilisation. The nature of the crops grown and their succession in the crop rotation determine the timing and duration of the periods between crops during which the nitrate ion present, or produced in the soil by the mineralisation of organic matter, is likely to be leached. In a given soil/weather situation, the amount of nitrate transferred into aquifers increases when the period between harvest and the sowing of the following crop is longer, especially in winter.

However, quite apart from the timing and duration of the growing period of the crop, the amount of nitrate nitrogen lost from a cultivated soil, i.e. not retrievable by subsequent crops, can also vary according to the characteristics of the species grown, such as rooting depth, ability to extract water from the soil, nitrogen content of the crop residues, etc. Thus nitrogen losses after maize are generally much higher than after sorghum, although their growing seasons are concomitant. It is the same for spring-sown peas and barley, the nitrate nitrogen losses usually being more after the pea crop even though it never receives any nitrogen fertiliser.

The permanent occupation of the land by vegetation, growing as much as weather conditions allow, constitutes the ideal solution to restrict to a minimum the nitrogen losses from cropping systems. Grassland, which is a typical example, may nevertheless allow leaching of nitrate, sometimes in considerable quantities. This is particularly true for grazed pastures for which part of the nitrogen which the animals return to the soil while grazing is unavoidably leached. The magnitude of the losses depends greatly in this case on how the pasture is managed, and particularly on the balance between cutting and grazing. They also depend on the intensity of nitrogen fertilisation which, by increasing grass growth, increases the stocking density of the grazing animals. To introduce legumes into pastures as a substitute for nitrogen fertilisation has no effect on the phenomenon.

Whatever the nature of the ecosystem, the transfer of nitrate into the aquifer is inescapable. It mainly originates from the soil organic matter whose mineralisation produces more nitrate when the amount of organic nitrogen in the soil is greater. In cultivated ecosystems, replacing nitrogen fertiliser by solutions considered more “ecological” such as the introduction of legumes into the cropping system, does not always change the phenomenon in the way it is hoped.

Professeur Thomas ADDISCOTT et Professeur David POWLSON

IACR – Rothamsted – Harpenden – UK

La dynamique de l'azote dans le sol – Impact des

pratiques agricoles

Pratiquement toutes les formes d'activité de production aboutissent à des pollutions particulières, et l'agriculture n'y fait pas exception. Elle entraîne des nitrates et des phosphates vers les eaux naturelles et des oxydes d'azote gazeux dans l'atmosphère. Les pertes de nitrate vers les eaux ont provoqué des inquiétudes généralisées et des dépenses importantes, à la fois des gouvernements et de l'industrie. Les modes d'exploitation du sol ont des répercussions fortes sur la production de nitrates dans le sol et la perte de nitrate du sol dans l'air et dans l'eau, que ces nitrates soit minéralisés dans le sol ou proviennent des engrais. Les stratégies de gestion des nitrates dans l'environnement dépendent donc d'une bonne compréhension du comportement des nitrates dans les sols et de l'influence des pratiques agricoles sur celui-ci. Cet article donne un bref aperçu de cette compréhension, dans l'état actuel des connaissances.

Le "problème des nitrates" (Nitrate Problem) qui est le thème central de cette conférence, est essentiellement un problème de nitrate "inopportun"(untimely) : le nitrate qui se trouve au mauvais endroit, au mauvais moment. Une grande partie de ce texte, traitera des raisons pour lesquelles le nitrate est présent et comment le problème peut être évité. Les nitrates sont présents dans le sol, parce que ils ont été apportés en tant que fertilisants, ou parce qu'ils ont été produits par la population microbienne, fongique et d'invertébrés du sol, et, de plus en plus, parce qu'ils ont été déposés par l'atmosphère.

Les études dans lesquelles, l'azote des fertilisants est marqué (ou tracé) avec l'isotope 15 de l'azote, montrent qu'environ 70% de l'azote apporté à un blé d'hiver (normalement près de 200 kg/ha), se retrouvent dans le grain et la paille. Les chaumes et les racines restant dans le sol ainsi que les exsudats racinaires contiennent près de 15% de l'engrais sous forme organique. Seulement 1% se retrouve sous forme minérale (nitrate et ammoniaque), le reste étant perdu par dénitrification ou lessivage. Le climat détermine quelle voie de perte prédomine, à chaque saison, mais, en moyenne, près des 2/3 sont perdus par dénitrification et un tiers par lessivage. Les pertes directes par lessivage des engrais sont donc relativement faibles, généralement de l'ordre de 5 à 6%. La betterave sucrière est même plus efficace que le blé d'hiver pour la réduction des pertes de nitrate, mais d'autres cultures, notamment les pommes de terre, le sont beaucoup moins.

Les entraînements directs ne sont pas les seuls problèmes. L'azote des engrais, qui reste sous forme organique, peut éventuellement être reminéralisé, à un moment potentiellement inopportun. De telles pertes indirectes par lessivage peuvent devenir importantes, si l'azote des engrais s'accumule dans les résidus organiques pendant une longue période. Cette accumulation peut également être perçue comme un accroissement de la fertilité.

La quantité relativement limitée d'azote lessivé, évoquée pour le blé d'hiver, peut s'accroître sévèrement si un excès de fertilisant est apporté. Cet aspect, comme la possibilité de lessivage indirect, suggère qu'une des clés essentielles de la gestion du problème des nitrates porte sur l'évaluation précise des besoins d'azote. Ceci est un sujet qui a été abondamment développé, et les modèles informatiques prennent une part importante et croissante dans l'aide à la décision de l'application d'engrais.

Les microorganismes qui sont responsables de la minéralisation de la matière organique du sol, l'accomplissent quand les conditions leur sont favorables, plutôt que quand les cultures en ont besoin. Ils apprécient particulièrement les conditions qu'ils trouvent lorsque le sol réchauffé par l'été, est réhumidifié au début de l'automne, mais c'est justement à ce moment que le nitrate est le plus indésirable. Le sol cultivé ne présente pas de végétation à cette période et la pluie va rapidement percoler à travers le sol pendant quatre à six mois. Ce nitrate produit naturellement est généralement responsable de la part principale du nitrate lessivé du sol, plutôt que l'azote des fertilisants apporté au printemps au cultures en croissance; ainsi, le maintien d'un couvert végétal et la gestion de la minéralisation sont deux éléments clé supplémentaires pour régler le problème des nitrates.

La couverture végétale est plus efficacement assurée avec les prairies, et peu de nitrate est perdu dans les eaux de drainage, quand l'herbe est exploitée en foin ou en ensilage, même avec des apports passablement élevés d'engrais azoté. La prairie est cependant utilisée souvent pour le pâturage, et l'introduction des animaux rend le système beaucoup moins étanche vis à vis des nitrates. Ceci s'explique du fait que les animaux pâturent l'essentiel de la surface, mais excrètent seulement sur quelques secteurs peu étendus créant ainsi des zones sur lesquelles beaucoup plus d'azote est déposé que les plantes ne peuvent en absorber. L'excès d'azote dans ces zones, est facilement transformé en nitrate par la biologie du sol et lessivé.

La couverture végétale des sols peut être assurée, dans un système de culture en semant, tôt en saison, des cultures d'hiver. Ceci constitue maintenant une technique usuelle pour de nombreux agriculteurs, mais elle a été suspectée de transférer des maladies d'une culture à l'autre. Les "cultures pièges à nitrates" peuvent aussi être pratiquées pendant l'automne et le début de l'hiver, pour prélever les nitrates du sol avant leur fuite, mais celles-ci présentent deux inconvénients. Le premier porte sur l'utilisation de l'eau qui aurait été, sinon, utilisée par la culture suivante, le second concerne la disponibilité des nitrates prélevés par les plantes qui, souvent, ne sont pas relargués assez rapidement pour profiter à la culture suivante, après labour de printemps.

La minéralisation est un processus entièrement naturel, et elle peut être aménagée seulement dans certaines limites. Le nitrate est produit dans le sol sans aucune intervention humaine. Des mesures faites au Centre de Recherche de Rothamsted montrent que, déjà dans les années 1870, la composition en nitrate des eaux de drainage d'un sol non cultivé qui n'avait reçu aucune fertilisation depuis au moins dix ans, dépassait la limite actuelle de 50mg/l. Ce nitrate avait été produit dans le sol, par la minéralisation de la fraction azotée de la matière organique. Tout effort de gestion de la minéralisation de l'azote implique évidemment la limitation des apports de résidus azotés s'accumulant dans le sol, et ceci peut constituer un des avantages d'applications d'engrais soigneusement ajustées. Le labour est aussi à prendre en compte, car il peut assurer l'enfouissement des pailles après récolte.

Le labour est bien connu pour favoriser la minéralisation du carbone et de l'azote de la matière organique, dans le sol, en exposant des agrégats du sol, auparavant enfouis, à l'oxygène et aux microorganismes, et en apportant à ces derniers, de nouvelles sources d'énergie. Les différents modes de labours varient considérablement sur l'aspect modification de la structure du sol et sur l'intensité de celle-ci. Ils diffèrent aussi sur les quantités d'énergie qu'ils apportent au sol. Ces différences influent sur les microorganismes et les animaux du sol qui effectuent la minéralisation et qui métabolisent le carbone et l'azote organiques. Il est bien possible que l'effet général du labour consiste à augmenter l'apport de nitrate dans le sol, souvent à l'automne quand il est susceptible de se lessiver. Cette difficulté est levée si le labour incorpore dans le sol, la paille non récoltée (qui ne doit plus être brûlée en Europe). La paille contient peu d'azote, et les microorganismes du sol utilisent les ions nitrates, quand ils la dégradent, réduisant ainsi, la quantité à risque.

Nous pouvons résumer ce texte, en disant que la gestion du problème des nitrates, consiste dans des bonnes pratiques agricoles qui limitent les quantités d'azote dans le sol tout au long des saisons et, spécialement, lors du début de la période de lessivage hivernal.

Practically all forms of productive activity lead to pollution of some kind, and farming is no exception. It loses nitrate and phosphate to natural waters and gaseous nitrogen oxides to the atmosphere. Losses of nitrate to water have caused widespread concern and large expenditure by both governments and industry. The way the land is managed has a strong effect on the production of nitrate in the soil and the loss of both soil-produced and fertilizer nitrate from the soil to air and water. Strategies for managing nitrate in the environment therefore depend on a clear understanding of the behaviour of nitrate in the soil and the influence on this of agricultural practice. This paper gives a brief account of this understanding as it stands at present.

The ‘nitrate problem’ with which this conference is concerned is essentially a problem of untimely nitrate, nitrate which is in the wrong place at the wrong time. Much of this paper is concerned with why it is there and how the problem can be avoided. Nitrate is present in the soil because it has been applied as fertilizer, because it has been produced by the soil’s population of microbes, fungi and invertebrates or, increasingly, because it has been deposited from the atmosphere.

Studies in which nitrogen from fertilizer is labelled (or ‘tagged’) with the isotope ¹⁵N show that roughly 70 percent of the nitrogen (normally about 200 kg/ha) applied to winter wheat crops is recovered in the harvested grain and straw. Stubble and roots remaining in the soil together with any material exuded from the roots contain about 15 percent of the fertilizer in organic form. Only one percent remains as mineral nitrogen (nitrate + ammonium) and the rest is lost by denitrification or leaching. The weather determines which loss pathway predominates in a particular season but, on average, about two thirds of the loss is by denitrification and one third by leaching. Direct leaching losses from fertilizer are therefore relatively small, commonly as little as 5-6 percent. Sugar beet is even more efficient than winter wheat at restricting nitrate losses, but some other crops, notably potatoes, are much less efficient.

Direct leaching losses are not the only problem. The fertilizer nitrogen, which remains in organic form, will eventually be re-mineralized, possibly when it is most untimely. Such indirect leaching losses can become important if fertilizer nitrogen accumulates in organic residues over a long period of time. This accumulation can, of course, also be regarded as an increase in soil fertility.

The relatively small direct leaching loss cited for winter wheat can increase sharply if too much nitrogen fertilizer is applied. This, together with the possibility of indirect losses, suggests that one of the keys to managing the nitrate problem is the correct assessment of the amount of nitrogen needed. This is a topic which has attracted great attention, and computer models are playing an increasingly important part in decision-support for fertilizer application.

The microorganisms that are active in mineralizing soil organic matter do so when the conditions suit them rather than when crops need nitrogen. They particularly enjoy the conditions which they find when soil warm from the summer is re-wetted during early autumn, but this is just when the nitrate they produce is most untimely. Arable soil is bare of vegetation at that time and rain will soon be percolating through it for four to six months. This naturally-produced nitrate is usually responsible for a larger proportion of the nitrate leached from the soil than fertilizer nitrogen applied to growing crops in spring, so maintaining vegetative cover and managing mineralization are two further keys to managing the nitrate problem.

Vegetative cover is most effectively maintained in grassland, and little nitrate is lost in drainage when grass is grown to be harvested as hay or silage, even with fairly large applications of nitrogen fertilizer. Grass is, however, commonly used for grazing, and the introduction of animals makes the system far more leaky with respect to nitrate. This happens because the animals graze most of the area but excrete on small areas of it, causing patches on which far more nitrogen is deposited than the grass can absorb. The surplus nitrogen in these patches is readily converted to nitrate by the soil population and leached.

Vegetative cover can be extended in arable systems by sowing winter crops early. This is now standard practice for many farmers, but it has been suggested to cause diseases to be carried over from one crop to the next. ‘Catch crops’ can also be grown during autumn and early winter to pick up nitrate from the soil before it is lost, but these have two problems. One is that they use water that would otherwise have been available to the following crop, and the other is that when they are ploughed into the soil in spring, as usually happens, the nitrate they have trapped is not released quickly enough to benefit the following crop.

Mineralization is an entirely natural process, and it can be managed to only a limited extent. Nitrate is produced in the soil without any human intervention. Measurements made at Rothamsted showed that, even back in the 1870s, nitrate concentrations in water draining from an unploughed soil that had received no nitrogen fertilizer for at least ten years exceeded the present-day EC limit of 50 g m^-3. This nitrate was produced by the mineralization of nitrogen-containing organic matter in the soil. Any attempt at managing the mineralization of nitrogen clearly involves limiting the amount of nitrogenous residues accumulating in the soil, and this should be one of the benefits of carefully-managed fertilizer applications. It can also involve tillage, which may include the incorporation of straw after harvest.

Tillage is well known to enhance the mineralization of carbon and nitrogen in organic matter in the soil by exposing previously unexposed soil surfaces to oxygen and microbes and by providing the latter with new sources of energy. The various tillage systems differ considerably in the way they modify the soil structure and the extent to which they do so. They also differ in the amounts of energy they put into the soil. These differences have an impact on the microbes and soil animals which bring about mineralization as they metabolize organic carbon and nitrogen. The overall effect of tillage is likely to be to increase the amount of nitrate in the soil, often in autumn when it is vulnerable to leaching. This problem is alleviated if the tillage incorporates unharvested straw (which can no longer be burnt in Europe) into the soil. Straw contains little nitrogen, and soil microbes utilize nitrate when they break it down, thereby lessening the amount at risk.

We can summarize this paper by saying that managing the nitrate problem is a matter of good agricultural practice which minimizes the amount of nitrate in the soil throughout the season and especially as the winter leaching period approaches

La nouvelle directive "eau potable" n°98/83/CEE du Conseil du 3 novembre 1998, relative à la qualité des eaux destinées à la consommation humaine, abroge à compter de son entrée en vigueur la directive n°80/778/CEE.

Toutefois, l'entrée en vigueur de cette nouvelle directive n'est prévue que cinq ans après son adoption, soit le 3 novembre 2003.

A compter de cette date, les Etats membres disposeront d'un délai de deux ans pour transposer les dispositions de cette directive, des dispositions spéciales étant prises pour assurer la conformité de l'eau distribuée dans les Etats membres aux paramètres plomb précisés dans l'annexe I.B de la directive.

Le champ d'application de la directive est extrêmement large puisque sont concernées les eaux de boisson, qu'elles soient distribuées par un réseau d'adduction ou bien en bouteille (à l'exception des eaux considérées comme eaux minérales naturelles ou eaux médicinales) ainsi que les eaux utilisées dans l'industrie alimentaire "sauf s'il peut être établi que l'utilisation de ces eaux n'affecte pas la salubrité du produit fini" (considérant n°7).

De plus, la directive pose le principe selon lequel le respect des valeurs paramétriques doit être assuré au point où les eaux destinées à la consommation humaine sont mises à la disposition du consommateur concerné c'est à dire, si besoin est, à la sortie du robinet (article 6 paragraphe 1, a & considérant n°21).

Bien plus, la nouveauté de la directive est d'obliger les Etats, d'une part à prendre les mesures nécessaires pour déterminer les causes et mettre en place les mesures correctives lorsque les paramètres définis aux annexes ne peuvent être respectés dans une partie d'un Etat membre et, d'autre part, permet aux Etats membres d'organiser des dérogations "dans la mesure où aucune dérogation ne constitue un danger potentiel pour la santé des personnes et où il n'existe pas d'autres moyens raisonnables de maintenir la distribution des eaux destinées à la consommation humaine dans le secteur concerné" (article 9, paragraphe 1).

Dans le même temps, la directive fait obligation aux Etats membres d'instituer toutes les mesures utiles de façon à ce que l'eau distribuée ou destinée à la consommation humaine ne présente aucun danger pour la santé, quelle que soit par ailleurs la conformité de cette eau aux paramètres fixés en annexe de la directive (moins nombreux que les paramètres fixés par la précédente directive).

Il est prévu à ce titre, lorsqu'un Etat membre décide d'instituer des paramètres complémentaires à ceux prévus par les annexes de la directive ou bien de diminuer les valeurs des paramètres existants dans les maxima admissibles, une procédure d'information de la Commission.

Enfin, la fixation des paramètres est justifiée par les considérants de la directive, au regard des orientations de l'Organisation Mondiale de la Santé relatives à la qualité des eaux potables ainsi que sur l'avis du Comité Scientifique Consultatif de la Commission pour l'examen de la toxicité et de l'éco-toxicité des composés chimiques.

Par ailleurs, il est rappelé (considérant n°13) que "les valeurs paramétriques reposent sur les connaissances scientifiques disponibles et que le principe de précaution a également été pris en considération ; que ces valeurs ont été choisies pour garantir que les eaux destinées à la consommation humaine peuvent être consommées sans danger pendant toute une vie et qu'elles offrent donc un degré élevé de protection sanitaire".

C'est donc une directive assez contrastée dont une des caractéristiques est de fixer deux critères pour qu'une eau puisse être propre à la consommation humaine, d'une part qu'elle respecte les paramètres fixés en annexe de la directive, d'autre part qu'elle ne présente aucun danger pour la santé humaine.

Ce second critère englobe d'une certaine façon le premier puisqu'il est expressément prévu que c'est au regard de la protection de la santé humaine que sont fixés les paramètres en annexe.

Il convient en outre, de préciser que deux aspects connexes résultent de modifications législatives récentes en France, à savoir :

- la responsabilité du fait des produits défectueux prévue par la loi n°98-389 du 19 mai 1998 insérant les articles 1386-1 à 1386-18 dans le Code Civil,

- la loi n°98-535 du 1^er juillet 1998 relative au renforcement de la veille sanitaire et du contrôle de la sécurité sanitaire des produits destinés à l'homme, modifiant et complétant le livre VIII du Code de la Santé Publique par un chapitre IX instituant notamment une agence française de sécurité sanitaire des aliments.

Cette dernière loi a été complétée par un décret n°99-242 du 26 mars 1999.

En revanche, il ne semble pas que le dispositif législatif et réglementaire mis en place pour prévenir les risques de saturnisme ait une incidence directe dans l’immédiat sur les règles relatives à la distribution de l’eau.

En effet, les décrets du 11 juin 1999 ne concerne que les peintures au plomb, et les poussières qu’elles provoquent.

Ces deux dispositifs ne sont pas sans incidence sur les régimes de responsabilité en cause du fait de la présence de nitrate à des teneurs supérieures aux normes admises dans les eaux destinées à la consommation humaine.

Les règles relatives à la responsabilité, sur laquelle la directive n’aura semble-t’il qu’un effet indirect, découlent de deux éléments :

· Les consommateurs sont dans une relation contractuelle avec le distributeur

· La distribution de l’eau est un service public industriel et commercial assuré par les communes (ou leur délégués).

· La réglementation européenne laisse aux états membres de l’UE le pouvoir de fléchir

I Une responsabilité renforcée du producteur ou du disributeur d’eau

Par la qualification de l’obligation de résultat

Par une nouvelle définition du préjudice

II Une responsabilité potentielle de l’Etat et des collectivités locales

Par la possibilité de fixer les normes et non de les subir

Par l’obligation de protection de la ressource

Implications for Regulation

Conclusion

Jean Louis L'Hirondel

POTENTIALITE DES NITRATES POUR LES ANIMAUX DOMESTIQUES

Assises Internationales ENVIROBIO: 13-14 novembre 2000 – Paris

References

I Une responsabilité renforcée du producteur ou du disributeur d’eau

II Une responsabilité potentielle de l’Etat et des collectivités locales